Id1在乙型肝炎病毒相关性肝脏疾病中的表达
【摘要】 目的 探讨DNA结合/分化抑制蛋白1(Id1)在病毒性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化和乙肝病毒感染相关肝细胞癌（HCC）中的表达及其临床意义。 方法 免疫组织化学SP法研究病毒性乙型肝炎40例、乙型肝炎肝硬化30例、HCC 65例及癌旁肝组织40例中Id1的表达情况。 结果 Id1在HCC中表达上调，与分化程度呈正相关(r=0.550，P<0.001)，在无转移肿瘤中及≤5 cm肿瘤中表达上调(P<0.05)；Id1在病毒性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及HCC中的表达、在病毒性乙型肝炎与HCC及乙型肝炎肝硬化与HCC表达的差别有统计学意义（P<0.05）。 结论 Id1在乙型肝炎病毒性肝脏疾病中的表达上调，为原发性HCC的诊断及治疗提供一定的理论依据。
【关键词】 抑制因子,免疫； 癌,肝细胞; 肝肿瘤； 肝炎病毒, 乙型； 肝硬化
肝硬化和乙型肝炎病毒是肝细胞癌（HCC）发生的重要危险因素，有报道HCC中80％患者同时患有肝硬化；而我国肝癌患者的乙型肝炎表面抗原阳性率为63.2％[12]，这表明HBV持续感染的肝脏炎症和肝脏纤维化与肿瘤的形成之间有一定关系。DNA结合/分化抑制蛋白1(inhibitor of differentiation/DNA binding1，Id1)是1990年代发现的一种分化抑制因子，可促进细胞增殖，参与肿瘤的血管形成，促进肿瘤的生长及转移[3]，但在HCC中的作用尚未清楚。笔者选择慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及HBV感染的HCC病例，研究Id1在其中的表达情况，并探讨其临床意义。
1 对象与方法
1.1 对象 收集病毒性乙型肝炎患者40例，男性23例，女性17例，年龄中位数33岁（19～45岁）；乙型肝炎肝硬化患者30例，男性21例，女性9例，年龄中位数41岁（18～47岁）。手术切除且病理证实为HCC患者65例，男性47例，女性18例，年龄中位数49岁（27～68岁）。均经病理证实，术前检查均为HBV感染，未进行任何化疗、放疗治疗。组织按癌细胞分化程度分级，以有无淋巴结转移和/或门静脉癌栓作为判断肿瘤转移的指标。取距肿瘤3 cm镜下无癌的癌旁组织40例及15例因外伤手术切除的正常肝脏标本作为对照组。
1.2 方法 标本经10％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片。采用链酶抗生物素蛋白过氧化物酶免疫组织化学（SP）法。柠檬酸抗原修复缓冲液高温高压抗原修复3 min；内源性过氧化物阻断剂(SP Kit9710，福州迈新公司)封闭内源性过氧化物酶活性30 min；Id1兔抗人多克隆抗体1∶100（Santa Cruz C20, USA）4 ℃孵育过夜；依次加入正常非免疫动物血清、生物素标记的第二抗体及链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶(SP Kit9710)，各孵育10 min，DAB显色3 min；苏木素复染1 min。以磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）置换一抗，其余步骤相同作为阴性对照。
1.3 结果判断 Id1免疫组织化学染色计分由阳性细胞染色强度和阳性细胞百分比两部分组成，具体为：根据免疫组化阳性细胞染色强度(A)，阳性反应为胞膜或胞质内出现棕黄色颗粒状染色，弱强度染色为1分，中等强度染色为2分，高强度染色为3分；阳性细胞百分比(B)：11％～50％为2分，>50％～80％为3分，＞80％为4分。＜10％阳性细胞，不管其表达强度，均计为(-)，A＋B为3分者计为弱表达()，4～5分者计为中等强度表达()，6～7分者计为强表达()[4]。把阴性表达与弱表达组归为Id1低表达组，而把中等强度表达与高表达组归为Id1高表达组。
1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包进行χ2检验；Spearman等级相关分析比较Id1与HCC的分化程度的相关性；单向有序秩和检验和Nemenyi检验比较肝炎组、肝硬化组与HCC组之间Id1表达情况，P<0.05为差别具有统计学意义。
2 结 果
2.1 Id1在正常肝脏组织、慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及HCC中的表达 Id1表达于细胞质中，在正常组织中无表达或低表达，而在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及HCC中均有不同程度的表达（图1）。Id1在病毒性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及HCC中的表达与在正常肝组织中的表达之间差别有统计学意义，Id1表达的高低与肿瘤的大小及转移有一定的相关性（表1）。
2.2 Id1在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及HCC中表达的关系 比较三组Id1的表达情况差别具有统计学意义。多独立样本两两比较可见慢性乙型肝炎组与HCC组、乙型肝炎肝硬化组与HCC组之间的差别存在统计学意义，而慢性乙型肝炎组与乙型肝炎肝硬化组之间的差别无统计学意义（表2）。
2.3 Id1在HCC中的表达情况与HCC分化程度的相关性 Id1在HCC中的表达与HCC的分化程度成正相关关系，即在高分化HCC中，Id1呈高表达；而在低分化HCC中，Id1呈低表达（表2）。 表1 Id1在HCC中的表达与临床病理关系表2 Id1在不同肝病组织中的表达及其与HCC分化程度的关系
3 讨 论
有学者认为，HCC的发生是一个多步骤的进程，即从腺瘤样增生到非典型腺瘤样增生再到极高分化HCC，而硬变肝组织中再生结节的形成可能就是这一系列步骤的开始，是HCC形成的第一步[4]。这是一个肝细胞再生的过程，而肝细胞恶变可能就是在肝细胞再生过程中发生的。用单向有序秩和检验分析Id1在病毒性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及HCC中的表达情况，发现Id1在三者间表达的差别有统计学意义，但Nemenyi法进行两两比较后发现病毒性乙型肝炎与HCC中Id1的表达及乙型肝炎肝硬化与HCC中之间表达差别存在统计学意义，而病毒性乙型肝炎与乙型肝炎肝硬化之间Id1的表达差别不存在统计意义；这可能与选材有关，因为30例乙型肝炎肝硬化的患者均处于ChildPugh A状态，故推测随着肝硬化的病情进展，Id1在肝硬化中应该会有更高的高阳性率，需要扩大样本量进一步研究。在肝炎与肝硬化中，肝细胞都处于一种不断的受炎症刺激状态，而此种刺激会引起肝细胞的破坏及肝细胞的增生，可能使肝细胞发生恶变，从而引发肝癌的发生。肝癌的发展过程生长过程是一个去分化的过程，即小肝癌逐步进展为大肝癌，并从高分化型发展到低分化型，肝门束减少，肿瘤内血管增多[1]。但亦有研究发现，在肝脏疾病中，血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶与增殖细胞核抗原之间没有相关性，提示肝细胞的增生不能都归因于炎症的刺激[56]。而Id1在细胞癌变过程的促进细胞过度增殖中起到重要作用。最近的研究更是表明Id1通过诱导细胞周期G1期到S期的过渡而启动DNA的合成，及通过抑制RB/P16途径而延长细胞的寿命[710]，据此推测Id1参与促进肝细胞增殖，引起肝细胞恶变进而发生HCC的过程。研究表明Id1可以作为肿瘤早期阶段的预测标志物[1011]，也有研究表明在非癌性肝硬化组织中Id1有38％呈强表达，学者通过随访肝病患者的HCC发生率，用COX比例风险回归模型分析了非癌性肝硬化组织的患者HCC发生率及其Id1表达率之间的关系后认为，Id1在HCC的早期发生中起重要作用，Id1可作为预测HCC发生的有效分子标志物，而高表达的Id1可能是预测慢性肝炎肝硬化患者的肝癌发生风险有价值的指标 [12]。本实验结果表明Id1在病毒性乙型肝炎到乙型肝炎肝硬化再到HCC中Id1的强阳性表达率逐渐升高（虽然病毒性乙型肝炎到乙型肝炎肝硬化中Id1的表达之间没有显著性差异），说明Id1参与了HCC的早期发生，并在HCC的早期发生中起到促进细胞增值的作用；本组实验结果可能为将来进一步研究可作用于Id1启动子的相关因子及研究Id1在肝癌发生发展过程中的作用及机制奠定了实验基础。
本研究中，在乙型肝炎Id1表达和乙型肝炎肝硬化Id1表达跟HCC中Id1的表达情况间存在显著性差异，在HCC中Id1的强阳性率高于肝炎组与肝硬化组，且Id1与肿瘤的大小、有无转移及肿瘤分化程度之间存在相关性，即Id1高表达于小肝癌、无转移的HCC中，而从高分化→中分化→低分化，Id1的表达也逐渐降低，这些结果均提示Id1可能参与HCC癌细胞的去分化；Id1在HCC发生的早期事件中起到关键的作用，而在晚期肝癌则不起重要作用，笔者认为Id1可作为早期预测HCC的一个分子生物学指标。
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