毛细管电安培法测定复方磺胺甲噁唑片中的有效成分

中华首席医学网    2008年03月05日 20:42:59 Wednesday  

 

作者：楚清脆 田秀慧 江莲梅 周文君 叶建农

作者单位：（华东师范大学化学系, 上海 200062）

《分析化学》医学期刊（新）2008年3月8卷3期 研究报告

 

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【摘要】  采用毛细管电泳安培法（CEAD）同时分离测定了磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole, SMZ）、磺胺嘧啶（sulfadiazine, SD）和抗菌增效剂甲氧苄胺嘧啶（trimethoprim, TMP）3种常用磺胺类抗菌药物成分，考察了实验参数对分离、检测体系的影响。在优化实验条件下，以 300 μm碳圆盘电极作为工作电极，检测电位为1050 mV（vs.SCE），在Na2B4O7（13 mmol/L）KH2PO4（18 mmol/L）（pH 5.8）的缓冲溶液中，分离电压18 kV，进样6 s，3组分在14 min内可实现基线分离。上述3组分浓度分别在5×10－4～5×10－2、5×10－4～０．1和5×10－4～5×10－2 g/L范围内与其峰电流强度呈线性关系，检出限达５.１×１０－５～８.０×10－5 g/L（S/N=3）。该方法已成功应用于复方磺胺甲噁唑片中抗菌活性成分的含量测定，结果令人满意。

【关键词】  毛细管电泳，安培检测，复方磺胺甲噁唑片，磺胺甲噁唑，磺胺嘧啶，甲氧苄胺嘧啶

　　Determination of Effective Ingredients in Compound Sulfamethoxazole Tablets by Capillary Electrophoresiswith Amperometric Detection

　　Chu QingCui, Tian XiuHui, Jiang LianMei, Zhou WenJun, Ye JianNong

　　(Department of Chemistry, East China Normal University, Shanghai 200062)

　　Abstract  A highperformance capillary electrophoresis with amperometric detection (CEAD) method has been employed for the determination of three antibacterial sulfa components, namely sulfamethoxazole (SMZ), sulfadiazine (SD), and trimethoprim (TMP).  The effects of several factors on CEAD were investigated.  Under the optimum conditions, the three components could be well separated within 14 min in a 70cm length capillary at the separation voltage of 18 kV, injection time of ６ s in a 13 mmol/L borax 18 mmol/L potassium dihydrogen phosphate running buffer (pH 5.8).  The above three analytes had good linear relationship between peak current and concentration of analytes at the range of 5×10－4－5×10－2 g/L, 5×10－4－0.1 g/L, and 5×10－4－5×10－2 g/L， respectively, and the detection limits (S/N=3) ranged from 5.1×10－5 to 8.0×10－5 g/L for all analytes.  This proposed method has been successfully applied for the determination of the main effective components in Compound Sulfamethoxazole Tablets.

　　Keywords  Capillary electrophoresis, amperometric detection, Compound Sulfamethoxazole Tablets, sulfamethoxazole, sulfadiazine, trimethoprim

　　本文系长春应用化学研究所电分析国家重点实验室基金（No.2007005）资助课题
* Email: jnye@ecnu.edu.cn

　　1  引  言

    复方磺胺甲噁唑片（又称百炎净）是目前临床广泛使用的抗菌药，主要由磺胺甲噁唑（SMZ）和甲氧苄胺嘧啶（TMP）及一些制剂辅料组成，其中两种主药SMZ和TMP是质量控制的关键指标。TMP与磺胺药合用可使细菌的叶酸合成代谢遭到双重阻断，有协同作用，增强磺胺药抗菌活性，使抑菌作用转为杀菌作用，减少耐药菌株产生，临床主要用于敏感菌所致的小儿急性中耳炎、成人慢性支气管炎、尿道感染及肠道感染等。两种主药的快速测定一直是广大科研工作者关注的问题。目前，高效液相色谱法[1～4]、双波长薄层扫描法[5,6]、分光光度法[7,8]和毛细管电泳法[9～12]等已应用于上述主药成分含量的测定，但存在操作繁琐、运行液缓冲体系复杂、线性范围窄、检测灵敏度较低及分析成本高等不足。此外，联磺甲氧苄啶片（主药成分为SMZ、磺胺嘧啶(SD)和TMP）的质量标准收载于《中国药典》2000 年版二部，其含量测定方法分别采用紫外分光光度法（测SD）、容量法（测SMZ）和氯仿提取后紫外分光光度法测定（测TMP）。上述方法操作繁杂，误差较大。

    毛细管电泳（CE）由于具有分离效率高、分析速度快、样品和试剂用量少以及毛细管易清洗等优点，被逐渐视为一种高效的分离分析技术。与安培检测（AD）方法联用，CEAD对电活性物质具有较高的灵敏度和选择性[12,13]。因而，本研究采用CEAD法建立了对TMP、SD和SMZ 3种磺胺类药物成分的同时分离测定方法，为该类抗菌药物的监管提供了一种简便、可靠、灵敏的新方法，3组分的分子结构如图1所示。该方法已成功地应用于市售复方磺胺甲噁唑片中主药成分SMZ和TMP的含量测定。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂

    CEAD检测系统（自组装）[13]。±30 kV高压电源（中国科学院上海应用物理研究所）;BAS LC4C安培检测器（Bioanalytical Systems, USA）;EB100型台式单笔记录仪（上海大华仪表厂）;Model 14901三维微定位器（Stratford, CT, USA）;70 cm熔融石英毛细管（i.d. 25 μm，o.d. 360 μm，河北永年锐沣色谱器件有限公司）。

    标准品SMZ（东京化成工业株式会社），SD和TMP（Sigma公司）。3种标准品储备液用无水乙醇配制，其浓度分别为1.0 g/L SMZ、0.5 g/L SD和1.0 g/L TMP，置于冰箱中4 ℃冷藏保存。其它所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。3批复方磺胺甲噁唑片（山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司）。所有实验在室温条件下进行。

　　2.2  实验方法

    取不同批次（061219、061209和070204）复方磺胺甲噁唑片各3片，分别准确称量约1/40颗药片（约含SMZ 10 mg，TMP 2 mg）后，在研铂中磨成粉末状，置于25 mL称量瓶中，用10 mL无水乙醇超声溶解10 min，以6000 r/min离心10 min，经0.22 μm聚丙烯滤膜过滤，所得滤液经运行液稀释后可直接供CEAD系统分析。所有样品溶液使用前置于冰箱中4 ℃冷藏。

　　2.3  电泳条件

    工作电极为300 μm的碳圆盘电极，使用前先用金相砂纸抛光，并置于水中超声清洗5 min，然后借助三维微定位器，使工作电极与毛细管出口在一条直线上，并尽可能靠近毛细管的末端。三电极体系包括碳圆盘工作电极、铂丝辅助电极和饱和甘汞参比电极（SCE）。用BAS LC4C安培检测器检测氧化电流，电泳图谱由EB100型单笔记录仪记录。采用电迁移进样，使用18 kV电压从毛细管阳极端进样6 s，检测池为阴极电泳池。

　　3  结果与讨论

　　3.1  运行缓冲液类型、酸度和浓度的影响

    由于硼酸盐能与待测物螯合生成络合阴离子来增加溶解度，可减少因吸附造成的峰拖尾等影响[1４]。所以，本实验主要考察了Na2B4O7H3BO3和Na2B4O7KH2PO4体系pH值与各组分迁移时间的关系，如图2所示。在Na2B4O7H3BO3缓冲体系中，pH在8.7～9.96范围内，如图2A所示，TMP与系统峰，SMZ与SD的电泳峰始终重叠，均不能实现分离；在Na2B4O7KH2PO4缓冲液体系（pH 5.8～6.6）中，当pH值＜6.0时，各组分可实现基线分离，随着pH值的增加，被分析物的荷质比发生变化，改变了其迁移时间，使得TMP与系统峰， SMZ与SD的分离度逐渐变差。所以，本实验采用pH 5.8的Na2B4O7KH2PO4缓冲液作为运行液。

　　在上述最佳条件下，考察了运行液浓度对被测物迁移时间的影响。结果表明，随着运行液浓度的增加，溶液离子强度增大，有效zeta电位降低，从而降低了电渗流（EOF），使分析物迁移时间变长，同时峰展宽现象逐渐明显。故本实验选择了13 mmol/L Na2B4O7～18 mmol/L KH2PO4缓冲液（pH 5.8）作为运行液，3组分可在14 min内实现基线分离。

　　3.2  工作电极电位的影响
   
　　其它实验条件和标识同图2B (other experiment conditions and labels were the same as in Fig.2B)。1.甲氧苄胺嘧啶(TMP), 2.磺胺嘧啶(SD), 3.磺胺甲噁唑(SMZ), sp：系统峰(system peak)。实验考察了3组分的动态伏安曲线以获得最佳工作电极电位。如图3所示，当电极电位>800 mV时，3组分均能在工作电极上产生氧化电流，且随着氧化电位的增加，3组分的峰电流迅速增加。当电极电位>1050 mV时，其氧化电流增加趋于平缓。此外，当电极电位>1100 mV时，基底噪音开始增强，继而导致基流不稳，不利于检测的稳定性和灵敏度。因而，本实验选择检测电位1050 mV作为工作电极电位，此时背景电流不大，且信噪比（S/N=3）较高，工作电极也表现出良好的稳定性和重现性。

　　3.3  分离电压和进样时间的选择

    本实验在14～22 kV范围内考察了分离电压对各分析物迁移时间的影响，如图4A所示。实验结果表明：分离电压越高，各组分迁移时间越短；但当电压>20 kV时，系统基底噪音加大，故本实验选择18 kV作为分离电压，在此电压下，各组分在14 min内可实现较好分离。

    进样时间决定进样量，影响分析物峰电流的大小和峰宽。在18 kV进样电压下，研究了在2～10 s范围内进样时间对峰电流的影响。如图4B所示，进样时间在2～6 s时，分析物峰电流随着进样时间的增加而增大。但当进样时间>6 s时，峰电流趋于稳定，同时峰扩展趋于明显。因此，在此实验中，选择6 s作为最佳进样时间。 

　　上述实验，在所选择的最佳条件下，3组分在14 min内即可实现基线分离，其标准混合溶液的电泳谱图见图5A所示。

　　3.4  重现性、线性范围及检出限

    在优化条件下，本实验采用将3组分标准混合溶液（各分析物浓度均为1.0 mg/L）连续7次进样的方法来评定CEAD系统的重现性。各组分峰高和迁移时间的RSD分别为3.1%、0.5%（TMP），2.7%、0.7%（SD）和2.1%、0.9%（SMZ）。上述实验结果进一步验证了本实验方法的可行性。

    在优化条件下，对不同浓度（5.0×10－4～1.0×10－1 g/L）的TMP、SD和SMZ的标准溶液分别进行测定。对各分析物的峰电流和浓度进行回归分析，从而计算出其线性回归方程和相关系数，结果如表1所示。结果表明，各组分峰电流与其浓度分别在5×10－4～5×10－2 g/L（TMP）、5×10－4～0.1 g/L（SD）、5×10－4～5×10－2 g/L（SMZ）范围内呈良好线性关系。以信噪比（S/N=3）对应，3组分检出限（LOD）达(5.1～8.0)×10－5 g/L。本方法的精密度和灵敏度与已报道的毛细管电泳[９]和液相色谱方法[4]相比，在精密度相当的情况下，本方法具有线性范围宽、检测灵敏度高的特点。表1  3种分析物的线性回归方程及其检出限（略）

　　3.5  样品测定及回收率

    在优化条件下，对不同批号的复方磺胺甲噁唑片中的主药成分TMP和SMZ进行了含量测定，其样品提取液的典型电泳图谱见图5B。采用标准加入法和与标准混合溶液电泳图（图5A）中分析物迁移时间相对照，检测出实际样品中确含有TMP（峰1）和SMZ（峰3），SD未检出，测定结果列于表2中。表2  复方磺胺甲噁唑片的测定结果（略）

    为了评估CEAD方法的精确度和准确度，以复方磺胺甲噁唑片（批号061219）样品为例，采用标准加入法对实际样品进行了回收率实验（n=3），实验结果如表3所示，其回收率为96.6%～102.3%。上述分析结果表明，本方法准确性好、灵敏度高，可以用于上述各组分的同时分离检测。表3  复方磺胺甲噁唑片的回收率测定结果（略）

　　实验结果表明，CEAD检测法具有较好的准确性、选择性和重现性，是一种有效定量分析复方磺胺甲噁唑片中主药成分的新方法。

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