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核桃仁中多酚类物质的液相/电喷雾质谱分析

首席医学网      2009年06月10日 11:57:42 Wednesday  
 

作者：王克建 杜明 胡小松 齐建勋 郝艳宾    作者单位：1（北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093） 2（哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨 150090） 3（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

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【摘要】  利用HPLCESIMSn方法对核桃（Juglans regia L.）仁中多酚类物质组成进行了分析，发现的多酚类物质有鞣花酰基葡萄糖4种异构体、橡椀酰基葡萄糖2种异构体、二鞣花酰基葡萄糖2种异构体、二没食子酰基葡萄糖2种异构体、鞣花酰基和橡椀酰基葡萄糖3种异构体。结果表明，采用HPLCESIMSn方法可以对核桃仁中多酚类物质进行有效的分析。

【关键词】  核桃仁，没食子单宁，鞣花单宁，液相色谱／电喷雾质谱

　1  引  言

    核桃（Juglans regia L.）别名胡桃、羌桃，属胡桃科核桃属植物，核桃仁中除了含有丰富的不饱和脂肪酸和优质蛋白质外，还含有丰富的多酚类物质，其单宁类物质含量可达372～1095 mg（以儿茶素为计量单位）/100 g仁干重[1]。Anderson等[2]采用LCELSD/MS方法对核桃仁中多酚类物质进行了初步分析，研究表明核桃仁中含有鞣花酸单体，聚合鞣花单宁和其它的酚酸类物质；以鞣花酸为对照，进行体外的低密度脂蛋白抗氧化实验，结果表明鞣花酸和核桃提取物对AAPH（2,2′Azobis hydrochloride，2，2′偶氮2眯基丙烷）诱导的低密度脂蛋白的氧化的抑制率分别是87%和38%；对Cu2+诱导的低密度脂蛋白氧化的抑制率分别是14%和84%。Fukuda等[3]采用乙醇在室温下进行粗提，再用不同溶剂分步提取，正丁醇提取的部分经过大孔吸附树脂（Diaion HP20）和甲基丙烯酸聚合树脂（Toyopearl HW40）梯度洗脱后，从核桃仁中分离、鉴定出了2,3HHDP（六羟基联苯二酰基，俗称鞣花酰基）葡萄糖和异小木麻黄素等15种鞣花单宁，它们均具有SOD的活性，对DPPH（二苯代苦味酰自由基）也有明显的清除作用。鞣花单宁在人体内转化成鞣花酸被人体吸收，鞣花酸通过人类线粒体途径对克隆的癌细胞Caco2产生凋零作用，而对正常细胞无影响[3]；来源于不同植物的鞣花单宁和鞣花酸都具有抗氧化的特性[2,4,5]。

    综上所述，已采用了不同的方法对核桃仁中的多酚类物质的构成进行了分析研究，但是由于多酚与黄酮类、蒽醌类、简单酚和木质素等在植物体内共存，性质相近，其本身更是一类结构和性质都极为相似的混合物，并且多酚的性质较为活泼，很容易发生缩合或者降解反应，采用传统的分离和提纯的方法对多酚组成进行精确测定比较困难；高效液相色谱/电喷雾/质谱（HPLCESIMSn）法可以在缺少标准品的情况下对粗提物中微量（ng）的成分进行有关结构分析，具有操作简单，灵敏度高的优点[5～8]。因此，为了进一步充分认识核桃仁中鞣花单宁类物质，本研究采用HPLCESIMSn法对其进行分析。2  实验部分

    2.1  仪器与试剂

    LTQ液相色谱质谱联用仪（Thermo Electron公司），TCC18柱 (50 mm×4.6 mm, 5 μm， Aglilent公司)，SK3200HP超声波萃取仪（上海科导公司）、FA1004型电子天平（上海精科天平厂）。乙醚和磷酸(分析纯)，没食子酸、鞣花酸、乙腈和甲醇为色谱纯，以上试剂均为Sigma公司产品。

    2.2  样品处理

    核桃（Juglans regia L.）采自北京市农林科学院林业果树研究所核桃品种园，品种为“薄壳香”。称取磨碎后的核桃仁100.0 g，用正己烷浸泡脱脂2次，每次2 h，过滤，滤渣用甲醇浸泡2次，每次1 h，表1  高压液相洗脱条件

    2.3  色谱质谱条件

    自动进样器（20 μL），流动相：水(A)和乙腈(B)，均含有0.1% 乙酸，洗脱条件见表1。    流速为 0.1 mL/min，解吸附温度380 ℃，源温度350 ℃，离子能力35 eV；解吸附气流 1200 L/h；毛细管温度350 ℃；ESI源电压5 kV；毛细管电压33 V；管透镜电压95 V。负离子模式，m/z扫描范围50～2000 Da。

　　3  结果与讨论

    植物多酚种类繁多，Haslam将植物多酚分为聚棓酸酯类（含水解单宁及其相关化合物）和聚烷醇类（含缩合单宁及其相关化合物）两大基本类型。聚棓酸酯类多酚根据水解后产生多元酚羧酸的不同分为棓单宁（水解后产生棓酸）和鞣花单宁（水解后产生鞣花酸或其它与六羟基联苯二酸有生源关系的物质，最常见的如云实素、黄棓酚、脱氢二鞣花酸、橡椀酸等）[9～11]。所有水解单宁都是植物体内棓酸的代谢产物，均属于棓酸或与棓酸有生源关系的酚羧酸与多元醇形成的酯。因此，本实验对组成聚棓酸酯类多酚的基本构成单位棓酸和鞣花酸进行了质谱分析。

     3.1  没食子酸和鞣花酸的标样的HPLCESIMS2图

    标样没食子酸，分子量为170，采用负离子扫描时失去1个H，得到m/z 169分子离子峰（图1A）；在MS2中，分子离子峰m/z 169失去CO2[M－44－H]－，得到m/z 125的碎片离子（图1B）。

    鞣花酸，分子量为302，在负离子扫描时失去1个H，产生m/z 301分子离子峰（图2A）；在MS2中，m/z 301容易失去1个CO2 [M－44－H]－，得到m/z 257；失去1个CO2和1个CO，得到m/z 229；失去2个CO2和1个CO，得到m/z 185（图2B）。碎片离子m/z 257, 229与文献[12～14]报道的相一致。

    图1  没食子酸标样在负离子扫描模式下的电喷雾/质谱图（A）及其二级质谱图（B）

    Fig.1  HPLCESIMS spectrum of standard gallic acid (A) and its MS2 spectrum (B) in negative ion mode图2  鞣花酸标样在负离子扫描模式下的电喷雾/质谱图（A）及其二级质谱图（B）

    Fig.2  HPLCESIMS of standard ellaglic acid (A) and its MS2 spectrum (B)in negative ion mode3.2  核桃仁中多酚物质的鉴定

    在负离子扫描模式下，采用反相高压液相色谱质谱的方法对核桃仁粗提物中多酚类物质进行了分析，在MS2、MS3碎片离子中可能含有没食子酸或/和鞣花酸的峰有20个。对这20个峰的碎片离子信息进行的分析讨论如下：

    图3  核桃仁提取液的高压液相（反相）色谱图

    Fig.3  Gradient reversed phase HPLC of an extract of walnut（Juglans regia L.）seeds

    图中标有数字的峰所对应的物质见表2(numbers of peaks refers to their subsequent identification by mass spectrometrywere shown in Table 2).峰1产生m/z 481的分子离子峰，即[M－H]－为481，分子量为482。在MS2中产生m/z 301（M－180，失去葡萄糖分子）的碎片离子，相对丰度为100%。m/z 301在MS3中产生与标样鞣花酸相同的特征离子峰（m/z 257, 229, 185），表明其含有鞣花酰基。Fukuda等[3]也报道了核桃仁（Juglans regia L.）中含有2,3HHDP葡萄糖。因此，峰1是鞣花酰基与葡萄糖相结合而成的化合物。

    峰2～5与峰1的质谱信息相同，可以认定它们也是由鞣花酰基与葡萄糖相结合而成的化合物。

    峰6产生m/z 331的分子离子峰，即[M－H]－为331，分子量为332。在MS2中产生m/z 169（M－162，失去葡萄糖基）碎片离子，相对丰度为100%。m/z 169碎片离子在MS3中产生主要碎片离子m/z 125，这与文献[14]报道的单没食子酰基葡萄糖的特征离子峰相一致。因此，峰6为单没食子酰基葡萄糖，分子式为C13H16O10，分子量为332。

    峰7和峰10均产生m/z 649的分子离子峰，即[M－H]－为649。m/z 649在MS2产生碎片离子m/z 605（M－44，失去1个羧基）。在MS3中，峰7的m/z 605产生的特征离子峰为m/z 481(相对丰度100%, m/z 605～124)，425，301。峰10的m/z 605产生的特征离子峰为m/z 425(相对丰度100%，m/z 605～180)，481，301，碎片离子m/z 425是橡椀酰基失去1分子羧基形成的。结合文献[15]的报道，峰7和峰10被确认为橡椀酰基葡萄糖。

    峰8和峰11均产生m/z 483的分子离子峰，即[M－H]－为483，分子量为484。在MS2产生的主要碎片离子有m/z 331（[M－153]－，失去没食子酰基），相对丰度为100%；m/z 169([没食子酸－H]－)和m/z 313（[M－没食子酸－H]－）。m/z 331在MS3中得到碎片离子为m/z 169、193、271、125，结合文献[15]的报道，认为峰8和11是二没食子酰基与葡萄糖糖形成的化合物，其结构可能为1，6二没食子酰基葡萄糖或2，6二没食子酰基葡萄糖。

    峰9产生m/z 169的分子离子峰，即[M－H]－为169，在MS2中产生碎片离子m/z 125，结合标样没食子酸的质谱信息，确定峰9为没食子酸。

    峰12和峰13均产生m/z 783的分子离子峰，即[M－H]－为783，分子量为784。峰12的m/z 783在MS2中产生的碎片离子m/z 481（[M－H]－HHDP，相对丰度100%）和m/z 301等；m/z 481在MS3中产生的主要碎片离子为m/z 437，由m/z 481失去CO2形成的。峰13的m/z 783在MS2产生的主要碎片离子为m/z 301(相对丰度为100%)和m/z 481。在MS3中m/z 301产生的碎片离子与标样鞣花酸的碎片离子吻合。依据上述信息并结合文献[3，17]报道，峰12和峰13被认定为二鞣花酰基葡萄糖。

    峰14，峰15和峰18均产生[M－H]－ 为951的分子离子峰。m/z 951在MS2中均失去CO2（m/z 44）获得碎片离子m/z 907（相对丰度100%）。m/z 907在MS3中产生的主要碎片离子m/z 783（m/z 907～124），m/z 605（m/z 907～302，失去1个鞣花酰基），481，301。依据上述质谱信息，认为峰14，15和18为鞣花酰基橡椀酰基葡萄糖，即为praecoxin A或其异构体。Hatano等[18]从旌节花科旌节花属植物（stachyurus）的叶片中分离出praecoxin A（2,3HHDP4,6Valglucose），praecoxin B、praecoxin C和praecoxin D 4种同分异构体物质。

    峰16产生m/z 633的分子离子峰，即[M－H]－为633，分子量为634。MS2的主要碎片离子m/z 301(m/z 633～332，失去没食子酰基与葡萄糖组成的化合物)和m/z 463(m/z 633～170，失去没食子酸)。在MS3中m/z 301产生的碎片离子与标样鞣花酸的碎片离子相同。依据上述质谱信息，峰16为没食子酰基鞣花酰基葡萄糖。在核桃仁中发现的小木麻黄素和异小木麻黄素均为没食子酰基鞣花酰基葡萄糖[5]。

    峰17产生[M－H]－为m/z 785的分子离子峰。在MS2中，m/z 785产生的碎片离子主要为m/z 301、483（m/z 785～302，失去1个鞣花酰基）和m/z 633（m/z 785～152，失去1个没食子酰基）；m/z 301的MS3数据表明其含有鞣花酰基。依据上述质谱信息，峰17被确认为二没食子酰基鞣花酰基葡萄糖。在核桃仁中发现的特里马素Ⅰ和特里马素Ⅱ就是二没食子酰基鞣花酰基葡萄糖[3]。

    峰19产生m/z 183的分子离子峰，即[M－H]－为183，分子量为184。m/z 183在MS2中产生主要碎片离子m/z 168（m/z 183～15，失去甲基）和m/z 124，与Owen等[16]报道的棓酸甲酯特征离子峰相吻合，确定峰19为棓酸甲酯。

    峰20产生m/z 301（100%）的分子离子峰，在MS2中产生碎片离子与标样鞣花酸特征离子峰相同，确定峰20为鞣花酸。

    一般认为，在植物体内六羟基联苯二酰基（HHDP）可能是多棓酰基葡萄糖分子内的2个位置相近的棓酰基之间发生脱氢耦合形成的。由于棓酰基之间的空间相对位置不同，使得HHDP的构型分为R和S两种；HHDP与糖环常见的连接方式为O2O3或/和O4O6，这时葡萄糖为最稳定的椅式4C1构象，HHDP多数为S构型；另一种连接方式为O3O6或/和O2O4，这时葡萄糖为椅式1C4构象，HHDP多数为R构型，这种构象不如前者稳定，两类连接很少同时存在[19，２０]。因此,可以认为峰1(2)、3、4、5是因为HHDP与糖环连接方式的不同以及本身构型的不同而产生的4种同分异构体，其中峰1与峰2从液相色谱图判断为同一个峰；峰7和10是由于橡椀酰基中HHDP构型的不同或者是与葡萄糖连接位置的不同而产生的异构体；峰12和峰13含有2个HHDP，也是由于其构型的不同而产生异构体；峰14、峰15、峰18含有1个HHDP和1个橡椀酰基，也是由于HHDP部分构型的不同以及与葡萄糖连接位置的不同而会产生异构体。峰8和11含有2个没食子酰基，由于与葡萄糖连接位置的不同而产生异构体。

   4  结  论

    通过HPLCESIMSn的研究表明，核桃仁中含有丰富的多酚类物质，主要含有HHDP结构的鞣花单宁，对所有峰的鉴定结果汇总如表2所示。利用本方法在核桃仁中新发现许多多酚物质同分异构体的存在，如鞣花酰基葡萄糖有4种异构体，橡椀酰基葡萄糖有2种异构体，二鞣花酰基葡萄糖有2种异构体，二没食子酰基葡萄糖有2种异构体，鞣花酰基和橡椀酰基葡萄糖有3种异构体。说明本方法具有灵敏度高、原料前处理简单等优点；有关这些新发现物质的具体结构还有待于结合核磁等方法进行深入的分析研究。表2  核桃仁（Juglans regia L.）中多酚类物质组分鉴定

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