内皮素受体拮抗剂益米乐对糖尿病大鼠肾脏的保护作用
【关键词】 糖尿病肾病;降钙素基因相关肽;内皮素;,益米乐,;大鼠
【摘 要】 目的 探讨内皮素受体拮抗剂益米乐对糖尿病大鼠肾脏病变的保护机制。 方法 选择健康雄性Wistar大鼠42只，随机分为正常对照组（N组）、糖尿病模型组（D组）、益米乐治疗组（Y组）3组，每组14只。D组在大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病动物模型，Y组在建立糖尿病模型后，给予益米乐注射液50mg・kg -1 ・d-1 ，N组和D组肌注等量的生理盐水。实验4周、8周后，取大鼠的尿、血、肾组织标本，行生化及PCR检测。 结果 3组间大鼠体重、肾重.体重、血压、血糖、24小时尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮差异均有显著意义（P<0.05或P<0.01）。肾组织降钙素基因相关肽（CGRP）和内皮素（ET）的mRNA表达差异有显著意义（P<0.05）。 结论 益米乐通过抑制ET-1的分泌，促进CGRP的合成，从而减轻CGRP与ET的失衡，对糖尿病肾病有明确的保护作用。
【关键词】 糖尿病肾病;降钙素基因相关肽;内皮素;益米乐;大鼠
The protection effect of Yimile―an antagonist of endothelin receptor on the kidney of diabetic rats HE Wei
* ，LI Ying，HU Zhijuan，et al.
* Department of Internal Medicine，Hebei Provincial People's Hospital，Shiji-azhuang 050051，China
【Abstract】 Objective To investigate the protection mechanism of Yimile which is an antagonist of endothelin（ET）receptor on the Wistar rats with diabetic nephropathy.Methods 42healthy male Wistar rats were randomly di-vided into three groups，normal group，diabetic model group and treatment group，14rats in each group.The diabetic model was made by injecting STZ into the abdomen of rats.The rats in treatment group were given with Yimile injection50mg・kg -1 ・d -1 .The rats in normal group and diabetic model group were injected with equal quantity NS.On the4th and8th week after experiment，the rats'urine，blood，kidney tissue were collected and detected by biochemistry and PCR.Results There were significant differences in body weight，kidney.body weight，BP，blood glucose，urinary pro-tein quantity of24hours，SCR and BUN among three groups（P<0.05or P<0.01）.There were significant differ-ences in the mRNA expressions of calcitonin-gene-related peptide（CGRP）and endothelin（ET）in kidney tissue among three groups（P<0.05）.Conclusion Yimile has definite protection effect on diabetic nephropathy by inhib-iting the secretion of ET-1，promoting the composition of CGRP，relieving the unbalance of CGRP and ET.
【Key words】 Diabetic nephropathy;Calctionin-gene-related peptide;Endothelin;Yimile;Wistar rats
内皮素（endothelin，ET）是由21个氨基酸组成的酸性多肽，是目前所知体内作用最强的缩血管活性多肽之一，可致肾小球毛细血管收缩，尤其对出球小动脉收缩相对明显，致肾小球毛细血管血压升高;另外，ET活化系膜细胞磷脂酶A2 ，促进血栓素A 2 （TXA2 ）形成，导致肾小球毛细血管阻力增高;ET还可通过多种作用导致系膜区基质堆积、毛细血管基 膜增厚;促进血小板聚集从而导致微血栓的形成［1，2］ 。在糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的发生、发展中起重要作用，干预其作用过程是DN治疗的关键之一。益米乐是内皮素受体拮抗剂，目前已有少量临床研究证明可延缓DN的进展，但机制尚未明了。本实验旨在观察益米乐对糖尿病大鼠肾脏的保护作用并探讨其可能的机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物分组:健康、雄性Wistar大鼠42只，体重120～150g，鼠龄2～3个月（河北医科大学实验动物中心供给），随机分为3组:（1）正常对照组（N组）;（2）糖尿病模型组（D组）;（3）益米乐治疗组（Y组），每组14只。
1.1.2 试剂:链脲佐菌素（STZ，购自Sigma公司），益米乐（成都第一制药有限公司生产）。
1.1.3 仪器:LDZ4-0.8离心机，LIASYS全自动生化仪，美国强生One Touch II血糖仪，PE公司2400PCR仪，XY-1型血压检测仪，自动图像分析仪。1.2 方法
1.2.1 模型建立及治疗干预:取28只大鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素（溶于0.1mmol.L枸橼酸缓冲液，pH=4.5）65mg.kg，72h后取尾静脉血，测血糖>16.65mmol.L，为糖尿病大鼠模型建立［3］ ，随机分为糖尿病组（D组）和益米乐治疗组（Y组），每组14只。另取14只大鼠以等量枸橼酸缓冲液腹腔注射，为正常对照组（N组）。Y组大鼠给予益米乐50mg・kg-1 ・d-1 ，肌肉注射，N组和D组仅肌注等量生理盐水，实验期间大鼠自由进食、进水，不使用胰岛素及其他降糖药，每周测3次体重。实验4周、8周后观察结果。
1.2.2 标本收集:3组分别实验第4周、8周各处死7只。处死前1天采用代谢笼留取24h尿液，测尿量及24小时尿蛋白定量（比色法测定）;处死当天以3%水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，行右侧颈总动脉插管，并接XY-1型血压监测仪记录平均动脉压，收集血标本，测量下列生化指标:血糖（Glu）、血肌酐（SCR）、尿素氮（BUN）;取双肾去包膜称重，左肾用10%福尔马林固定，石蜡切片，作PAS染色及HE染色，每张切片随机选取20个肾小球;右肾用RT-PCR技术定量组织中降钙素基因相关肽（calcitonin-gene-related peptide，CGRP）与ET的mRNA表达，CGRP上游引物5'CGTGATCTTCTCTCTGCTGT3'，下游引物5'TTGACCCAGATGATGTCCAG3';ET上游引物5'GCATCTTGCTCCTGTACCAG3'，ET下游引物5'CTC-CCTGACTTTCATC-TGCA3'，分析各组间CGRP与ET的变化。
1.3 统计学处理 计量资料数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，所有数据用SPSS10.0统计软件处理，多组间均数比较采用方差分析，2组之间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 各组大鼠的体重、肾重.体重、血压及血糖的变化 试验后各组相比差异有显著意义（P<0.01或 P<0.05），见表1。 表1 3组大鼠8周后体重、肾重.体重、血压及血糖的变化注:与N组比较， * P<0.05， ** P<0.01;与D组比较， △ P<0.05
2.2 各组大鼠肾功能指标 试验后Y组24小时尿蛋白定量（TP.24h）、SCR、BUN明显低于D组而高于N组，经检验差异有显著意义（P<0.01或P<0.05），见表2。表2 3组大鼠8周后TP.24h、SCR、BUN的比较
2.3 肾脏组织形态学改变 8周后N组大鼠肾小球未见异常;D组大鼠可见92%肾小球系膜细胞增生，基质弥漫性增厚;Y组病理损伤较D组轻。见图1～4。
2.4 CGRP与ET的mRNA表达 4周和8周时，N组大鼠肾组织中CGRP的mRNA表达明显高于D组和Y组（P<0.05），而ET的mRNA表达明显低于D组和Y组（P<0.05）;Y组大鼠的肾组织中CGRP的mRNA表达明显高于D组（P<0.05），而ET的mRNA表达明显低于D组（P<0.05），见图5。图5 各组大鼠肾组织中CGRP与ET的mRNA表达情况
3 讨 论
糖尿病肾病是糖尿病微血管并发症之一，其确切机制尚未完全阐明，目前主要认为是肾血流动力学及非血流动力学两大因素综合作用的结果，涉及到肾素―血管紧张素、CGRP、ET等多种血管活性肽类物质的相互作用。其中CGRP与ET是两个重要而相互拮抗的活性多肽，在糖尿病肾病的发生、发展中起重要作用［4］ 。
CGRP是一种由37个氨基酸组成的活性多肽，是降钙素（calcitonin，CT）基因不同剪切的产物。CGRP广泛分布于中枢和外周神经系统，特别是感觉神经元的胞体和末梢（传入神经纤维），在血管系统中几乎所有的血管床均有CGRP能神经纤维分布，另外循环血中也有一定浓度的CGRP。CGRP是体内最强的舒血管物质之一，它可以通过下调ET受体的密度而拮抗ET的生物学效应，还可以增加NO和前列腺素的产生，抑制ET合成，是ET有效的内源性拮抗剂，二者处于相对平衡状态，维护血流动力学的稳定，维持血压的稳定;并且CGRP具有强大的细胞保护作用，是防止血管损伤的内源性保护因子，抑制血管平滑肌细胞增殖，对糖尿病的糖代谢紊乱产生一定影响。在DN的发生、发展中，肾素―血管紧张素系统活性显著增强，血管紧张素II增高，转化生长因子β（TGF-β）上调，诱导ET的合成和释放，增加的ET通过促进血管收缩，引起组织缺血、缺氧，造成高乳酸环境，可直接刺激含CGRP的神经兴奋，引起CGRP的释放增加，随缺血、缺氧加重，可导致CGRP免疫反应纤维减少，最终使CGRP释放减少，使二者的相对平衡状态被打破，此时ET浓度升高，使肾脏的血流动力学功能出现紊乱［5，6］ 。
国内外已有研究表明内皮素受体拮抗剂对DN有一定治疗作用，如Benigni等［7］ 在STZ诱发的糖尿病动物模型中，给予非选择性ET受体拮抗剂PD142893后15d发现，该拮抗剂能明显降低高血压及减少蛋白尿，并能阻止蛋白尿的进一步发展;Dhein等［8］ 研究发现ET A 受体拮抗剂LU135252可使肾小球直径增加，对抗糖尿病大鼠肾脏缺血;并完全抑制肾小球内类嗜伊红物质的沉积。益米乐是一种新型非肽类内皮素受体拮抗剂，选择性拮抗ET-1受体，适用于心血管、呼吸、肾脏等多种疾病［9］ 。本实验通过益米乐对糖尿病肾病的干预研究，发现治疗组大鼠体重、肾重.体重、血压、24小时尿蛋白定量、血肌酐均有明显改善;肾组织的病理改变明显减轻，AG和VG显著下降;肾组织中CGRP的mRNA表达明显 升高，ET的mRNA表达显著下降;从而证明益米乐 对糖尿病肾病有治疗作用。因益米乐能有效地阻断ET收缩血管的生理功能，促进CGRP的合成，从而缓解CGRP与ET的失衡，降低血压，改善肾脏的血流动力学，减弱肾小球毛细血管收缩，使毛细血管压降低，改善肾小球高滤过状态，从而减少尿蛋白;益米乐还可阻断ET促系膜区基质堆积和毛细血管基膜增厚的作用，并增强细胞保护，抑制血管平滑肌细胞增殖，从而延缓肾小球硬化和肾功能恶化，对糖尿病肾病有明确的保护作用，与已有研究资料相符［10，11］ 。
参考文献
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作者单位:050051 河北省人民医院肾内科（何伟，胡志娟，牛凯，刘冰，宗毅，曹珍，崔佳，郭岚）;河北医科大学附属第三医院肾内 科（李英）
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