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黄芪对糖尿病大鼠肾组织血管生成素受体Tie2表达的作用

首席医学网      2007年10月06日 22:03:00 Saturday  

 

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作者：顾红卫1, 倪兆慧1, 顾乐怡1, 严玉澄1, 戴慧莉1, 李宁丽2, 张敏芳1, 钱家麒1    作者单位：1. 上海交通大学医学院仁济医院肾脏科, 上海 200127　2. 上海交通大学医学院免疫研究所, 上海 200025

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【摘要】  目的：探讨血管生成素受体Tie2在糖尿病大鼠肾组织中的表达以及黄芪对其影响。方法：SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组和黄芪治疗组。8周后处死大鼠，采用实时定量聚合酶链反应和免疫组化法分别检测3组大鼠肾组织中Tie2基因和蛋白表达水平。结果：与正常对照组相比，糖尿病组大鼠肾组织Tie2蛋白表达显著升高（P<0.01）；黄芪治疗组大鼠肾组织Tie2蛋白表达较糖尿病组显著下调（P<0.01）。结论：黄芪通过下调糖尿病大鼠肾组织Tie2的表达而发挥肾保护作用是其治疗糖尿病肾病的作用机制之一。

【关键词】  糖尿病肾病; 血管生成因子; 黄芪; 大鼠

　　Effects of Astragalus on expression of renal angiopoietin receptor Tie2 in diabetic rats

　　Hongwei GU1, Zhaohui NI1, Leyi GU1, Yucheng YAN1, Huili DAI1, Ningli LI2, Minfang ZHANG1, Jiaqi QIAN1

　　1. Department of Nephrology, Renji Hospital, Medical College of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China

　　2. Institute of Immunology, Medical College of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China

　　Objective: To study the expression of angiopoietin receptor Tie2 in the renal tissue of diabetic rats and the effects of Astragalus.

　　Methods: SD rats were randomly divided into normal control group, diabetes group and Astragalustreated group. The expression of receptor Tie2 in the renal tissue was assessed by using realtime quantitative polymerase chain reaction and immunohistochemical method.

　　Results: Glomerule Tie2 protein expression was significantly elevated in the diabetes group as compared with the normal control group (P<0.01). Glomerule Tie2 protein expression in the Astragalustreated group was decreased as compared with the diabetes group (P<0.01).

　　Conclusion: Tie2 may play an important role in the pathogenesis of the early stage diabetic renal injury. The renoprotection effect of Astragalus may be mediated by downregulating the expression of Tie2 in the kidney tissue of diabetic rats.

　　Keywords: diabetic nephropathies; angiogenesis factor; Astragalus; rats

　　Gu HW, Ni ZH, Gu LY, Yan YC, Dai HL, Li NL, Zhang MF, Qian JQ. J Chin Integr Med / Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2007; 5(5): 536540. Received November 7, 2006; published online September 15, 2007. Free full text (PDF) is available at www.jcimjournal.com
   
　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）发病机制的研究和寻找有效的防治途径是目前医学界关注的热点，其发生、发展与血管内皮功能障碍以及许多细胞因子和生长因子异常表达有关。近年研究发现早期DN的发病机制类似于血管增生［1，2］。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）受体家族和Tie受体家族（Tie1和Tie2）是目前已知的参与血管生长发育的两大关键性酪氨酸激酶型内皮受体家族［3］。Tie2在血管内皮上表达，是目前所有已知血管生成素（angiopoietin, Ang）的唯一共同受体。研究发现Ang及其受体Tie2系统可参与肾脏疾病中肾脏微血管结构的改变、肾损伤后血管修复和重构［4］，但其在DN发病机制中所起的作用还不十分清楚。我们前期研究表明黄芪具有减少糖尿病大鼠蛋白尿，抑制肾脏肥大和纤维化的作用，但其确切的作用机制目前还不完全清楚。本文重点探讨黄芪对糖尿病大鼠肾组织中Tie2受体表达的影响，以进一步阐明黄芪发挥肾保护作用的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物模型及分组  雄性SD大鼠，清洁级，6周龄，体质量（200±10）g，共18只，购自上海中国科学院动物室。随机分成3组，正常对照组（n=6）、糖尿病组（n=6）和黄芪治疗组（n=6）。糖尿病组和黄芪治疗组大鼠一次性腹腔注射1％链脲佐菌素（streptozotocin, STZ, Sigma公司）柠檬酸缓冲液，按60 mg/kg体质量的剂量。正常对照组大鼠予等量柠檬酸缓冲液注射。48 h后用微量血糖仪测血糖，血糖值>16.5 mmol/L提示造模成功。黄芪治疗组大鼠每天予黄芪注射液（成都地奥九泓制药厂，批号0410082）灌胃，每天5 ml/kg（相当于生药每天10 g/kg）；其余两组每天以等剂量饮用水灌胃，共8周。观察期间，所有大鼠均自由饮水摄食，糖尿病大鼠予精蛋白锌胰岛素皮下注射，1次/周，每次2 U。

　　1.2  标本采集和指标检测  8周后，处死所有大鼠，处死前一天用代谢笼收集随意尿5 ml左右，离心后取上清，考马斯亮蓝比色法（碧云天）测尿蛋白浓度，并测尿肌酐，计算尿蛋白与肌酐的比值；处死当天大鼠，称取体质量后麻醉，股动脉穿刺后用M3046A检测仪（惠普公司，美国）有创测血压；下腔静脉采血，送各项生化检查；用冰生理盐水进行双肾的原位灌注后，切除左肾，去包膜，称取肾质量，并计算肾质量指数（肾质量/体质量）。将左肾上极或下极用10%中性福尔马林固定，用于免疫组化和光镜下分析；右肾皮髓质分离，肾皮质块用铝箔包裹并标记，置于液氮中暂存，随后保存于－70℃冰箱，备用于总RNA的提取。

　　1.3  肾脏病理检测形态学变化  2～3 μm石蜡切片行过碘酸希夫反应（periodic acid Schff reaction, PAS）染色。光镜下观察肾小球形态和系膜基质增生情况。每张切片随机选取皮质区30个肾小球，采用全自动图像分析系统（Imagepro Plus 5.0, 美国）分别计算各肾小球PAS阳性染色面积与肾小球截面积之比值，其均值即为每张切片肾小球细胞外基质的相对含量（glomerular relative extracellular matrix value, RM）［5］。平均肾小球体积（mean glomerular volume, VG）参考文献［6］公式计算：VG（×106 μm3）=1.25×［肾小球截面积（μm2）］3/2。

　　1.4  免疫组化法检测各组大鼠肾组织Tie2受体蛋白的表达  3 μm厚的石蜡切片常规脱蜡水化，用含3％过氧化氢的PBS封闭内源性过氧化物酶。然后依次加入一抗（武汉博士德公司产品，空白对照加PBS），HRP酶标记的二抗，最后DAB显色，苏木素复染，显微镜下观察和摄像。蛋白的相对表达量（％）按文献方法［7］进行检测。

　　1.5  实时定量聚合酶链法检测各组大鼠肾组织Tie2受体mRNA的表达  取50～100 mg肾皮质用液氮碾成粉末，Trizol法抽提出总RNA，测定其浓度，取5 μg总RNA逆转录成cDNA，用SYBR Green I嵌合荧光法进行实时定量聚合酶链法（realtime PCR）检测肾皮质中Tie2受体基因表达。用ABI Prism 7700序列检测仪及Applied Biosystems的SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行荧光定量分析。以大鼠βactin为内参照，具体引物序列见表1。具体反应步骤如下：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共40个循环；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。每个指标都重复检测一次，目的基因mRNA的相对定量按文献方法［8］进行计算。

　　1.6  统计学方法  应用SPSS 11.0统计软件分析，计量资料以x±s表示，多组均数的比较用单因素方差分析，采用Pearson相关对一些参数进行相关分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。

　　表1  Realtime PCR扩增基因的引物　　略

　　2  结  果

　　2.1  各组大鼠生理状况的改变  8周时，与正常对照组大鼠相比，糖尿病组大鼠体质量（body weight, BW）明显下降（P<0.01）；肾质量指数（kidney weight index, KWI）、收缩期血压（systolic blood pressure, SBP）、血糖（blood glucose, BG）和尿蛋白与肌酐的比值（Urine protein/creatinine, Upro/Cr）显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）；黄芪治疗组大鼠的Upro/Cr值较糖尿病组显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

　　表2  各组大鼠生理情况　略

　　2.2  各组大鼠肾脏病理学改变  糖尿病组大鼠VG和RM较正常对照组显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；黄芪治疗后，VG有所下降，但差异无统计学意义。见表3。

　　表3  各组大鼠VG和RM指标　略

　　2.3  Realtime PCR的检测结果  与正常对照组相比，糖尿病组大鼠肾皮质Tie2基因表达水平有所升高，经黄芪治疗后，大鼠Tie2基因水平下调，但差异无统计学意义。见表4。

　　2.4  免疫组化相对定量结果  与正常对照组相比，糖尿病组大鼠肾小球内Tie2蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；黄芪治疗后，受体Tie2蛋白表达较糖尿病组显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）。见表4和图1。

　　表4  各组大鼠肾组织内Tie2基因和蛋白的表达　略

　　图 1  各组大鼠肾小球Tie2蛋白表达及部位（略）

　　2.5  相关性分析结果  Tie2基因水平与VG存在显著正相关（r=0.639, P=0.004）。Tie2蛋白水平与Upro/Cr值和VG都存在显著正相关（r=0.612, P=0.007; r=0.616, P=0.006）。

　　3  讨  论
   
　　Ang及其受体Tie系统在人类疾病发生发展中的作用是最近的研究热点。作为Ang的受体蛋白家族，Tie1和Tie2可在内皮细胞和造血干细胞上表达［9］。已知Ang及其受体Tie系统与血管的生长、发育、成熟和渗透性密切相关，因此，它们是正常胚胎发育必不可少的生长因子［10］。Tie1基因敲除模型发现Tie1参与调节毛细血管内外的液体交换，Tie2基因敲除模型则显示Tie2与循环系统的稳定与维持有关。在胚胎发育过程中，若缺少Ang或Tie2信号途径则会导致内皮细胞的凋亡和胚胎死亡。出生后，受体Tie2在内皮细胞上表达，参与血管生成，是血管重塑和成熟的必要条件［11］。最近研究显示，在糖尿病视网膜病变中，Ang及其受体Tie2系统可协同VEGF及其受体胎肝激酶1系统参与视网膜微血管增殖性病变［12］，但其在糖尿病另一重要微血管并发症——糖尿病肾病中的作用并不清楚。糖尿病大鼠肾脏病理学检查发现肾小球毛细血管丛和肾小球截面积增大部分可能与糖尿病患者肾脏局部微环境中的VEGF和Ang2过度表达有关［2］。我们的研究结果与国外文献报道相似，发现8周时糖尿病大鼠肾组织中Tie2的表达已经升高，并且Tie2水平与VG和Upro/Cr值呈显著正相关。提示Ang及其受体Tie2系统可通过诱导糖尿病大鼠肾小球毛细血管增生而导致肾小球肥大；其次，Ang及其受体Tie2系统也可通过调节肾小球毛细血管的渗透性而导致肾小球高滤过和蛋白尿。这些结果均表明Ang及其受体Tie2系统在早期糖尿病肾病的发生发展中起重要作用。
   
　　目前研究发现，黄芪对多种肾病尤其是蛋白尿有明显的治疗效果［13～15］。然而，黄芪的肾保护作用机制尚未完全阐明。既往的观点认为黄芪治疗肾脏疾病的机制与改变血流动力学效应有关，但我们近年来的研究发现黄芪对一些在肾损害进展中起重要调节作用的生长因子也有影响，如黄芪可降低糖尿病大鼠肾皮质转化生长因子β1和基质的表达［16］，可诱导增加高糖环境下肾脏成纤维细胞表达肝细胞生长因子［17］，下调糖尿病大鼠肾组织β诱导基因克隆3基因和蛋白的表达水平［18］等。本实验显示黄芪可显著下调糖尿病大鼠肾组织Tie2的表达，提示黄芪还可能通过下调糖尿病大鼠肾组织的Ang受体Tie2蛋白和mRNA的表达而发挥肾保护作用。Ang及其受体Tie2系统在早期糖尿病肾病的发病中起重要作用。黄芪治疗糖尿病肾病的作用机制之一是通过下调糖尿病大鼠肾组织Ang受体Tie2的表达而介导。

【参考文献】
  　　1 Nyengaard JR, Rasch R. The impact of experimental diabetes mellitus in rats on glomerular capillary number and sizes. Diabetologia. 1993; 36(3):189194.

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