糖尿病并发感染时细胞因子以及胰岛细胞凋亡的变化①
【关键词】 糖尿病 感染时细胞因子 胰岛细胞凋亡
糖尿病（DM）并发感染常引起酮症酸中毒、多脏器衰竭等严重后果，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，而DM和感染易患性的病理生理学还不清楚［1，2］。本研究通过DM并发感染的大鼠模型，检测其血浆和胰腺组织中肿瘤坏死因子α（TNFα）、干扰素γ（IFNγ）和白细胞介素2（IL2）的蛋白水平以及胰腺组织中mRNA表达的定量分析，结合胰岛细胞凋亡的检测，了解高糖状态下可能加重的炎症损伤。
1 材料与方法
1.1 模型与分组 Wistar大鼠链佐菌脲霉素（STZ）诱发DM模型。盲肠结扎穿刺术（CLP）方法诱发腹腔多种细菌感染［3］。DM并发感染的模型是在STZ诱发血糖升高的基础上行CLP术，每组8只。
1.2 分子生物学研究 胰腺匀浆，Trizol提取总RNA，引物序列为：TNFα正链5′CGAGTGACAAGCCCGTAGCC3′，反链5′ TCCCTT TGCAGAACTCAGGAATGG3′；IL2正链5′GCGACCCACTTCAAGCCCT3′，反链5′CCACCACAGTTGCTGGCTCA3′; IFNγ正链5′CCCTCTCTGGCTGTTACTGC3′, 反链5′CTCCTTTTCCGCTTCCTTAG3′; β肌动蛋白（βactin）正链5′TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC3′，反链5′TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCCG3′。扩增程序：48℃逆转录45分钟，94℃预变性3分钟，30个循环程序为94℃ 45秒、60℃ 60秒、72℃ 30秒， 72℃延伸7分钟。2%琼脂糖中电泳，80 V 2小时，密度扫描，与βactin比值为mRNA的半定量指标。
1.3 ELISA方法测定 大鼠血浆和胰腺匀浆上清液采用双抗夹心ELISA方法测定TNFα、IFNγ和IL2浓度。
1.4 胰岛细胞的分离与纯化 大鼠胶原酶Ⅳ消化液，依次加入不同浓度Ficoll溶液进行梯度离心，去上清液成胰岛细胞悬液。
1.5 胰岛细胞凋亡检测 使用程序性细胞死亡检测试剂盒（鼎国生物）；染色的面积比率计算相对细胞凋亡率。
1.6 统计学处理 多样本均数之间应用F检验，方差不齐时选用秩和检验。胰岛细胞凋亡率的比较采用t检验分析，P<0.05为差异有显著意义。
2 结果
与正常组比较TNFα mRNA在DM组显著升高（P<0.05）,而IFNγ和IL2 mRNA在DM组无特异性改变; 感染组TNFα、IFNγ和IL2 mRNA相对值较正常组和DM组有意义地升高（均P<0.05）；DM并发感染组TNFα、IFNγ和IL2 mRNA水平与正常组和DM组比较有意义地升高，与单纯感染组之间无明显差异。
在循环中DM并发感染大鼠TNFα水平较正常组和DM组有明显升高（均P<0.05），与单纯感染组比较无明显改变；但胰腺组织中TNFα蛋白水平在DM并发感染组较其它各组明显升高(均P<0.05)；DM组与感染组TNFα胰腺内表达也较正常组升高,且两组之间也有显著性差异(P<0.05)。血浆中的IFNγ和IL2水平各组之间均无显著改变；胰腺组织中DM组的IL2水平较正常组升高，感染组和DM并发感染组IL2水平与DM组比较胰腺组织中有意义地升高（均P<0.05）；与正常大鼠相比，IFNγ表达在DM组未见显著改变，而IFNγ水平在感染组和DM并发感染组与DM组比较有意义地升高（均P<0.05），这两组之间无显著性差异。
细胞凋亡率DM并发感染组（32.18±5.41）显著性升高（均P<0.05）；DM组的细胞凋亡率(17.52±9.95)与感染组细胞凋亡率(10.45±2.93)之间的差异具有显著性（P<0.05）。
3 讨论
实验中多细菌感染的大鼠胰腺组织TNFα mRNA和蛋白表达均显著性升高，而血浆中的水平未见异常，这可能是由于促炎因子是以自分泌或旁分泌的形式作用的，达到一定浓度时进入循环，引起全身反应，刺激肝细胞产生急性期蛋白［7］。炎症反应过程中，炎症细胞分泌介质，促炎CK进一步刺激炎细胞产生更多的炎症介质，发生炎症的级联反应，使血管内皮细胞收缩、血管通透性增强，还能使白细胞和内皮细胞表面表达黏附分子，使中性粒细胞出现吞噬活性，释放蛋白水解酶和氧自由基，DM并发感染大鼠TNFα在胰腺组织的表达特异性升高可以反映促炎因子介导炎症的扩大和损伤的加重。
胰腺组织的TNFα mRNA定量、蛋白表达及血浆中的水平出现不一致性，除了上述的时相差外，还可能由于TNFα mRNA的稳定性受3′非翻译区位点调节，一个是对放线菌素u敏感，另一位点对其不敏感，此位点受LPS调节后TNFα mRNA的降解率和蛋白表达异常［6］。
DM大鼠CK改变的实验结果提示DM细胞免疫功能的变化。但在血浆中DM大鼠的这几种CK水平与正常对照组相似，与近年李旭光等［5］检测的2型DM患者IL2、IL8和TNFα水平与正常组比明显升高，2型DM并发感染患者与无感染者比较亦有显著增高，这一结果不完全一样。分析可能的情况：除了前文提到的CK自分泌或旁分泌外，还可能是由于临床结果的影响因素较多；此外实验数据还显示，与正常组比较DM大鼠血浆TNFα略高，但尚无统计学意义，进一步延长实验时间和增加标本量可能会证实结果。
胰岛细胞凋亡和胰岛功能损伤在DM的发生与发展中具有重要的作用［8］。随着研究的深入，发现细胞凋亡的诱导因素是多种多样的，而同一组织和细胞受到不同因素的诱导，其诱导凋亡的结果不尽相同［9］。我们认为，通过对DM并发感染等疾病的动物模型胰岛细胞凋亡的测定，某种程度上更能直接地反映在DM和/或感染产生的复杂诱导因子作用下胰岛细胞以及功能的改变情况。
实验结果显示DM并发感染组的胰岛细胞凋亡率高于其他各组，升高的因素：①STZ结构中的亚硝基脲是细胞毒的;②LPS引发的细胞凋亡需要单核细胞产生的多种细胞因子，主要包括TNFα以及糖皮质激素的共同参与，对胰岛细胞无特异性作用［1012］；③DM胰岛β细胞凋亡主要通过一氧化氮(NO)途径,IL1、TNFα和IFNγ等起中介作用［13］；④高血糖对胰岛β细胞具有毒性作用。在高葡萄糖条件下,培养的人胰岛细胞胞浆内Ca++浓度升高,葡萄糖浓度恢复正常后还持续存在,胞浆内高Ca++的持续存在会触发凋亡［8］。
【参考文献】
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13 陈 香, 田浩明. 糖尿病胰岛β细胞凋亡病因学机制 ［J］.中国糖尿病杂志, 2002;10（3）：175177.
(编辑 许四平)
①本课题受青岛市卫生局（市卫科9914）资助
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