人A C E2 基因真核表达载体的构建及其转染人内皮细胞的研究
【摘要】 目的：克隆人血管紧张素转换酶2（A C E2 ）基因，构建其真核表达载体并将之转染入体外培养的人血管内皮细胞中。方法：采用PC R 方法从人胎儿心脏cD N A 文库扩增出人A C E2 cD N A 全长基因，克隆到pcD N A311 -D／V5 -His 表达载体上，构建重组真核表达质粒ph A C E2 ，经酶切和测序鉴定。采用脂质体法将ph A C E2 转染至人血管内皮细胞中，分别利用实时定量PC R 和W estern 印迹检测重组A C E2 的m R N A 和蛋白的表达情况。结果：经PC R 、酶切和基因序列测定证实重组入载体的片段（2419 bp ） 为目的基因序列，在转染的内皮细胞中发现A C E2的m R N A 和蛋白的表达明显增加（P ＜ 0101 ）。结论：本研究成功构建并表达了pcD N A311 -h A C E2 重组真核表达载体，为该基因在高血压病防治中的功效研究奠定了基础。
【关键词】 肽基二肽酶A ；基因；质粒；高血压
Construction of recom binant eukaryotic expression plasmid containing human ACE2 gene and its transfection in human en2 dothelia cells
Z H O N G Jiu chang ，Y U Xi yong ，Y U Hui min ，LIN Qiu xiong ，Z H O U Zhi ling ，Y A N G Min
Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation M edicine ，2007 ，16 （4 ）：325
Abstract：Objective ：To clone and construct reco m binant eukaryotic expression plasmid containing hu man angiotensin converting enzyme 2（A C E2 ）and transfected it to hu man endothelial cells .Methods ：The full2length cD N A of hu man A C E2 was am plified from a H u man Fetal H eart cD N A Library by PC R ，and cloned into pcD N A311 -D／V5 -His ex2pression vector（ph A C E2 ）1 After the identification of enzy me digestion and sequencing ，ph A C E2 was transfected to
hu man endothelial cells by liposome ，and the m R N A and protein expression of A C E2 was determined by real2time PC R and W estern blot in endothelial cells respectively .Results ：The inserted frag ment of recom binant vector（2419 bp ）was the sequence of target gene by PC R ，enzy me digestion and sequencing determination ，and A C E2 m R N A ，and pro2tein expression were markedly enhanced （P ＜ 0101 ）in the transfected endothelial cells co m pared with controls .Con2clusion ：The recom binant eukaryotic expression plasmid pcD N A 311 -h A C E2 is successfully constructed and trans2 fected in cells ，which provided the basis for the study of A C E2 functions in the prevention and treatment of hu man es2sential hypertension .Author′s address ：Research Center of M edical Sciences ，Guangdong Provincial People′s H ospital，Guangzhou ，Guang2dong ，510080 ，China
Key words ：Pepttidyl2depeptidase A ；Gene ；Plasmid ；H ypertension
干预肾素-血管紧张素系统（R A S ） 是目前人类高血压病防治的主要手段［1 ］，因而对R A S 与高血压发病机理关系的研究方兴未艾。血管紧张素转换酶2 （A C E2 ） 是R A S 中新近发现的成员， 能与A C E 竞争催化血管紧张素原裂解成具有舒张血管功能的代谢产物， 从而减少血管紧张素II （A ng II ）的生成［2 ， 4 ］。A C E2 基因敲除后，机体A ng II 水平显著增加［5 ］。而A ng II 水平增加是R A S 激活的中心环节，是高血压病重要的发病机理。A C E2 的发现拓展了R A S 体系，为深入研究高血压病的发病机制及寻求更加符合生理的治疗策略提供了机遇。本研究旨在克隆和构建人A C E2 基因的重组真核表达质粒并转染至人内皮细胞内，并对其核酸序列进行分析，从而为深入研究A C E2 在高血压病基因治疗中的应用奠定了基础。
1 资料与方法
1.1 实验材料
T RIzol 试剂，Pfx UltimaT M D N A 聚合酶、pcD2N A311 -D／V5 -His 表达载体、脂质体、质粒提取试剂盒以及抗His 抗体等购自美国Invitrogen 公司；人血管内皮细胞系E A hy1926 由本研究室保存；抗A C E2 、抗β -actin 抗体由美国Santa Cruz 公司提供；细胞培养介质D M E M 与胎牛血清、人胎儿心脏cD N A 文库由美国Gibco 公司提供；pG E M -Teasy 载体、Taq 酶等其它试剂购自美国Pro mega 公司和日本Takara 公司。
1.2 A C E2 基因克隆、载体构建及转染
根据N CBI 网站人A C E2 基因全长编码序列（GenBank No .A F241254 ），用Primer 510 软件设计A C E2 特异性引物（正向引物为5′-C A C C A T2G T C A A G C T C T T C C T - 3′； 反向引物为5′- A A A G G A G G T C T G A A C A T C A T C A G -3′）。通过Pfx UltimaT M D N A 高保真聚合酶从人胎儿心脏cD2N A 文库扩增出人A C E2 cD N A 全长基因，D N A 测序检测扩增片段为2419 bp 。采用胶回收试剂盒纯化出PC R 产物，通过T4 连接酶与pcD N A311 -D／V5 -His 定向克隆表达载体连接成功后， 转化至T O P10 细胞中。随机挑取阳性克隆子，鉴定成功后进行细菌扩大培养。提取含A C E2 基因的阳性质粒D N A （p A C E2 ），经PC R 扩增、酶切以及D N A 测序鉴定后， 采用脂质体LipofectamineT M 2000 将之转染至常规培养的E A hy1 926 人血管内皮细胞中。
收集转染内皮细胞， 分别利用实时定量PC R 和W estern 印迹检测重组ph A CE2 基因和蛋白的表达况。另设正常培养的细胞对照组和空白质粒转染对照组。
1.3 实时荧光定量PC R 反应
转染细胞中A C E2 m R N A 表达水平测定采用实时荧光定量PC R ，方法同前。用引物（Primers ）软件设计人A C E2 基因的引物和Taq M an 探针（ 表1 ）。采用T RIzol 试剂提取转染细胞总R N A ，常规合成cD N A 。用pG E M - T easy 载体构建重组A C E2 质粒，验证成功的酶切D N A 进一步纯化后成为标准品。将标准品稀释成每μl 容积109 ， 103 不同拷贝数浓度梯度，建立定量的标准曲线并进行样品检测，反应体系为25 μl。同时设人3 -磷酸甘油醛脱氢酶（G A P D H ） 为内参基因。在荧光定量PC R扩增仪上进行观察、记录并分析结果。
1.4 W estern 印迹
用常规的W estern 印迹法检测转染细胞中A C E2 蛋白表达水平。先提取细胞总蛋白，用Brad2ford 法测定样品蛋白浓度。取50μg 总蛋白上样于预灌制的10 ， 12 %聚丙烯酰胺凝胶中，100 V 电泳2 h ，然后电转移至硝酸纤维素膜上。4 ℃封闭过夜，膜采用A C E2 一抗孵育1 h ， 洗膜3 次， 每次10min 。接着室温下用碱性磷酸酶标记的二抗孵育1h ，洗膜3 次，每次10 min 。最后用W estern blot 专用试剂（Pro mega ） 显色成像， 采用自动成像分系统对A C E2 特异性条带进行半定量分析，β -ac2tin 蛋白作为内对照。
1.5 统计学处理
采用SPSS 1010 版本统计软件进行分析，计量资料均采用均数±标准差（珚x ±s） 表示，组间比较
采用t 检验。P ＜ 0105 为差异有显著性。
2 结 果
2.1 重组A C E2 质粒的鉴定及目的片段测序分析
图1 示通过PC R 扩增（A ） 与双酶切（B ） 鉴定重组质粒pcD N A311 - D／V5 - His -h A C E2（ph A CE2 ）。第1 、第3 泳道为采用T7 、B G H引物扩增片段分别为2444 和2775 bp ；第2 、第4 泳道为采用人A C E2 特异性引物扩增片段分别为2088和2419 bp 。经测序鉴定发现长插入片段与目的片段相一致（即2419 bp ），而短插入片段与目的片段相差331 bp ，考虑为A C E2 选择性剪切的基因亚型。本研究中转染人内皮细胞实验采用的是全长h A CE2 插入片段。图1B 显示用内切酶Bam H I 和Xho I 对重组质粒进行双酶切， 产物片段约2419bp ，提示A C E2 基因克隆与插入成功。
2.2 真核表达质粒ph A CE2 在转染人内皮细胞中M 为D N A M arker （标志）
实时定量PC R 检测的转染人内皮细胞中ph A CE2 的m R N A 表达情况见图2 ， 单位为Log
A C E2 与G A P D H 基因拷贝数的比值。图2 A 为定量标准曲线，显示A C E2 阳性克隆的标准品起始模板浓度与循环阈值（C T ） 之间呈良好的线性关系（r 值为01996 ）。如图2B 所示，与对照组比，转染后的内皮细胞中ph A CE2 的m R N A 表达明显增加（5191 ±0113 ）∶（5105 ±0131 ）；n =5 ，P ＜ 0101 ，而空白质粒转染组则变化不明显（5103 ±0129 ） ∶（5105 ±0131 ）；n =5 ，P ＞ 0105 。与对照组比，转 染后细胞中ph A CE2 的蛋白表达水平增加，P ＜0101 （图3 ）。通过抗His 抗体W estern 印迹检测发现，在ph A CE2 转染的细胞中可检测到A C E2 -his融合蛋白的表达，而在对照组和空白质粒转染组中则未发现该融合蛋白的表达（图3 ）。
3 讨 论
R A S 是机体内调节水盐代谢、维持血压和心血管功能稳定的最重要机制之一，而A C E 及其新近发现的同源酶A C E2 是其中的关键作用子［1 ，6 ， 10 ］。尽管A C E2 基因与A C E 分子结构极为相近，两者在功能上则相互拮抗。A C E 把无活性的A ng I 转化为A ng II ，A ng II 是R A S 中起主要病理生理作用的组分，促使使血管平滑肌收缩，外周阻力增加，交感神经系统（S N S ）活性增加，促进醛固酮分泌增加与水钠潴留形成［9 ， 11 ］。而A C E2 可直接对抗A C E 与A ng II的作用。A C E2 能直接降解A ng I 和A ng II ，最终均水解产生A ng -（1 -7 ）［4 ，7 ］。A ng -（1 -7 ）为A T 1 受体有力的拮抗剂，可直接对抗A ng II 的血管收缩、血管增殖肥厚、S N S 激活等引发血压升高的因素［7 ］。
另外，A C E2 可诱导高血压体内一氧化氮（N O ）生成增加。N O 是一种强烈的舒血管物质，具有抗增殖、抗氧化、抗血小板粘附等生理特性，在维持血管张力的恒定和调节血压的稳定中起着重要作用［7 ，9 ，11 ］。既往研究中我们发现高血压中A C E2 基因表达与血清N O 水平存在一定的相关性［8 ］。A C E2 可通过促使A ng -（1 -7 ）的生成增加介导N O 的合成、释放以及血压调控作用。A ng -（1 -7 ）通过其自身受体M as
作用或通过A C E 与缓激肽2 型受体（B2 ）受体信号途径交叉对话（crosstalk ），促使B K 释放N O 增加［3 ， 5 ］。此外，A C E2 基因已被克隆并定位于X 染色体的Xp22 位点上，而经研究证实在高血压动物模型中A C E2 基因与和高血压相关的数量性状遗传位点（Q T L ）有重叠，且所得的优势对数分数值较高，提示A C E2 很可能是位于X 染色体上高血压Q T L 的一
个候选基因［5 ］。因此，A C E2 基因可通过直接对抗A C E 与A ng II 作用，促进A ng -（1 -7 ）的生成、改善胰岛素抵抗以及促进N O 释放等多种途径实现其血压调控功效。
A C E2 表达或活性异常可能参与高血压病的发生、发展过程，因而调节R A S 体系关键酶A C E2 的转录和／或表达成为防治高血压及其相关疾病的重要手段［1 ， 4 ］。本研究通过PC R 和D N A 测序分析发现，重组质粒插入人源性A C E2 基因一长一短两种片段，长插入片段与目的片段相一致，而短插入片段与目的片段相差331 bp ，考虑为A C E2 选择性剪切的基因亚型。选择性剪接是一种广泛的R N A 加工机制，为基因表达调控中转录水平的调控。通过对A C E2 可能的选择性剪接产物的功能研究将有助于了解人类A C E2 基因在血压调控中的作用及其可能存在的基因功能变异情况。同样对重组质粒进行双酶切反应后得出产物片段与目的片段相一致，提示A C E2 基因克隆与插入成功。通过实时定量PC R 和W estern印迹检测发现，在ph A CE2 转染的人内皮细胞中可检测到A C E2 的m R N A 及蛋白表达水平均明显增加，提示ph A CE2 成功地表达于体外培养的细胞中。
A C E2 表达或活性提升对高血压具有重要的病理生理意义，这些作用来自于阻断A ng II 所产生的血管收缩、血管平滑肌细胞增殖、氧化应激增强以及炎症效应［4 ，9 ， 12 ］。本研究利用基因重组技术，成功地克隆、构建及表达了含人A C E2 基因的全长编码序列，为下一步转基因细胞系的获得和动物模型的体内转染实验做好了准备，从而为深入探讨A C E2 在血压调控中的机理开辟了新天地，同时为高血压病防治提供了新的治疗靶标。
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基金项目： 中国博士后科学基金一等资助金项目（20060390195 ）；
广东省自然科学基金资助项目（7300041 ）；广东省医学科研基金资助项目（A2006047 ）
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