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Ⅳ型胶原酶与糖尿病肾病

首席医学网      2008年01月01日 01:47:37 Tuesday  

 

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作者：许娟，亓文波，亓春花    作者单位：泰山医学院，山东 泰安 271000

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【关键词】  糖尿病肾病；细胞外基质；基质金属蛋白酶

    基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一个大家族，因其需要钙、锌等金属离子作为辅助因子而得名，目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～26。Ⅳ型胶原酶，又称明胶酶，是其中较重要的一类，它主要有两种形式，一种为72KD Ⅳ型胶原酶,即MMP2（明胶酶A），以无活性的72KD酶原形式分泌，氨基酸端裂解掉80个氨基酸后被激活，变为66KD或62KD活化型，主要定位于肾小球，由结缔组织细胞分泌，另一种为92KD Ⅳ型胶原酶，即MMP9(明胶酶B)，其前酶原形式为78～82 KD，经裂解含有19个氨基酸的信号肽及多肽糖基化变成92KD的酶原形式，再裂解掉氨基酸端73个氨基酸成为84KD活化型，主要由中性粒细胞和巨噬细胞产生。Ⅳ型胶原酶能作用于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原及纤维结合蛋白（fibronectin，FN）、弹性蛋白和蛋白多糖，最主要的作用底物是Ⅳ型胶原，后者是肾小球基底膜和系膜基质的主要成份，为肾小球的结构支架，其合成的增加和降解的减少是糖尿病肾病发生发展的重要因素。目前在糖尿病肾病领域，无论是实验室基础研究还是临床标本检测方面，Ⅳ型胶原酶的研究均存在许多矛盾之处，现对MMP2，MMP9最新进展作一综述。

    糖尿病肾病的病理变化是肾小球及肾小管细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的积聚，电镜下可见肾小球系膜基质如胶原、层粘连蛋白（laminin，LN）、纤维接合蛋白等明显增加,ECM积聚的直接原因是ECM的产生和降解之间的平衡被打破，具有抗纤维化酶、促炎症介质双重身份的Ⅳ型胶原酶在肾脏局部和外周血表达和活性的改变，及其与其它细胞因子的相互作用是糖尿病肾病进展的关键环节。

    1  体外实验

    高糖能降低MMPs的表达，并通过降低纤溶酶的利用率和膜型1基质金属蛋白酶（membranetype 1 matrix metalloproteinase ，MT1MMP）的表达，影响MMPs的活性。早在1998年，McLennan等研究发现高糖培养的系膜细胞分泌92KD明胶酶（MMP9）下降，Singh等［1］也进行了一系列的研究发现高糖能降低系膜细胞MMP2 表达水平及活性，升高TIMP2水平，同时明显增加转化生长因子β1(transforming growth factorbeta1, TGFβ1)的表达，应用外源性TGFβ1能放大高糖降低MMP2活性的效应，而且TGFβ1抗体可以阻断高糖对MMP2活性的抑制，提示了高糖对基质金属蛋白酶的影响机制是通过TGFβ1介导。McLennan后来的研究表明，CTGF中和抗体能减轻高糖和TGFβ1导致的基质降解的下降，考虑到CTGF作为TGFβ1的下游调节因子，在抑制基质降解中也起到了一定作用，具体环节与TIMP1 表达增加有关［2］。赵志涛等［3］应用糖化牛血清白蛋白刺激体外培养正常大鼠肾小球系膜细胞，发现系膜细胞 MMP2 m RNA的表达明显下降，上清 MMP2活性明显降低，故认为晚期糖基化终末产物能降低大鼠肾小球系膜细胞MMP2的活性及表达。Han等［4］研究发现高糖和血管紧张素Ⅱ 明显降低肾近端小管细胞MMP2基因表达和活性，升高TIMP2 的水平，外源性的TGFβ1起到了相同的作用，TGFβ1抑制剂能抑制AngⅡ诱导MMP2和TIMP2的变化。Lee 等［5］研究发现，胰岛素增加鼠肾小球系膜细胞MMP2的活性，其机制是通过PI3激酶 和ERK1/2 MAPK信号激活途径完成。

    但黄海长等［6］应用明胶酶谱法和RTPCR方法观察TGFβ1刺激肾小球足突细胞后培养上清MMP9活性及细胞MMP9mRNA的变化，应用Western蛋白印迹法检测TGFβ1调节MMP9中对ERK信号途径和转录因子Ets1蛋白的影响，发现TGFβ1刺激细胞24h后培养上清MMP9活性明显升高，TGFβ1刺激 6h，细胞MMP9mRNA亦明显增加，TGFβ1刺激细胞4h，转录因子Ets1蛋白增加,持续高水平至24h，TGFβ1可以刺激细胞ERK1/2活化，ERK1/2活化阻断剂PD98059预处理细胞,可以阻断TGFβ1刺激引起的Ets1蛋白、MMP9活性、MMP9mRNA增加的效应，以上结果提示TGFβ1是通过活化细胞内ERK信号途径和上调转录因子Ets1蛋白刺激足突细胞MMP9mRNA表达,继而蛋白活性增加。后续应用肾络通对肾足细胞干预的实验中发现，高糖组足细胞培养上清MMP2的活性无明显变化，MMP9活性则逐渐升高，Ⅳ型胶原α5链蛋白表达逐渐下降，MMP9的活性与Ⅳ型胶原α5链蛋白的表达量呈负相关，应用肾络通可以抑制高糖诱导足细胞MMP9及Ⅳ型胶原α5链蛋白的异常改变［7］。在肾足细胞的研究中发现MMP9活性是升高的，与肾小球系膜细胞培养得出的结论不同。

    2  动物模型

    McLennan等［8］用RTPCR及酶谱法检测糖尿病大鼠肾脏MMP9和MMP2的基因表达和活性，发现MMP9mRNA表达及活性均降低，MMP2mRNA表达增加但活性降低，肾脏降解基质总能力下降，应用培哚普利治疗可减弱由于上述酶活性降低导致的Ⅳ型胶原的积聚。Dong等［9］通过免疫组化的方法发现在糖尿病大鼠模型中MMP2在肾小球中的表达是降低的，MMP9则无显著性变化，同时伴有肾小球和肾间质Ⅳ型胶原的表达升高，应用吡格列酮治疗可逆转糖尿病大鼠MMP2的下降，降低Ⅳ型胶原的表达，从而可能延缓肾纤维化的进展。Mankhey等［10］发现应用17β雌二醇（E2）补充给药能使糖尿病鼠肾脏降低的MMP2和MMP9蛋白水平升高，甚至超过非糖尿病鼠肾脏MMP2和MMP9水平，同时使降低的MMP2和MMP9酶活性升高至与非糖尿病鼠肾脏相似水平，从而发挥其降低蛋白尿、减缓肾小球硬化和肾小管间质纤维化的作用。

    晚期糖基化终末产物对肾脏损伤的机制中也有Ⅳ型胶原酶的参与，在糖尿病大鼠模型研究中发现糖尿病大鼠肾皮质AGEs含量明显升高，MMP2 mRNA表达下降，注射AGEs组大鼠肾皮质AGEs含量明显升高，MMP2 活性也明显下降［11］。Ⅳ型胶原富含赖氨酸和羟赖氨酸，生物半衰期很长，长期高糖环境使之发生非酶糖基化，糖化后的胶原分子形成共价交联，影响Ⅳ型胶原酶的表达和活性。在糖尿病肾脏损害中，TGFβ1这一重要的细胞因子也参与了MMPs的变化，最近，Krag等［12］给予TGFβ1转基因鼠和非TGFβ1转基因鼠注射链脲佐菌素(streptozotocin ,STZ),使血糖水平升高，8周后发现，单纯轻度高血糖对肾小球结构和ECM积聚无影响，而TGFβ1的过表达则使MMP2、MMP9、纤溶酶原激活抑制因子（plasminogen activator inhibitor1，PAI1）、金属蛋白酶组织抑制剂1基因表达增加，使肾小球基底膜增厚，ECM积聚，故认为上升的血糖水平和TGFβ1协同作用，通过影响基质金属蛋白酶等相关蛋白酶的表达，影响细胞外基质代谢，TGFβ1在血糖轻度上升的情况下协同加速肾脏病变的进展。

    在一项糖尿病胎鼠的研究中发现，糖尿病胎鼠后肾MMP2和MMP9的表达和活性明显下调，胎鼠肾脏TGFβ1和CTGF表达明显上升，提示胎鼠在子宫内暴露到母体糖尿病状态影响了Ⅳ型胶原酶和TGFβ1/CTGF系统，使肾脏发生受损，Ⅳ型胶原酶和TGFβ1/CTGF系统诱导ECM异常重塑，进而诱导胎鼠输尿管芽分支缺陷，导致肾单位减少，最终进展为慢性肾脏疾病和高血压［13］。

    但在下述研究中也得出相反结论，认为糖尿病肾病时肾脏组织基质金属蛋白酶表达是升高的。郭清华等［14］对Kkay小鼠糖尿病肾病时肾脏MMP9及其细胞内信号传导机制进行研究，发现Kkay糖尿病小鼠较非糖尿病小鼠肾小球硬化指数明显升高，肾脏组织MMP9 及其mRNA表达增加，应用AGEs作用于脐静脉内皮细胞， AGEs使脐静脉内皮细胞MMP9蛋白及其mRNA表达增加,并伴有核转录因子κB（ NFκB）激活，抑制NFκB的活性可降低MMP9表达，推测AGEs可能是通过激活NFκB使MMP9表达增强的，抑制NFκB活性可能减轻糖尿病肾病的程度。Rodriguez等［15］通过给予C57BL/6J鼠高脂、高热卡饮食建立2型糖尿病模型，并给予吡格列酮激活过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(peroxisome proliferatoractivated receptorgamma ，PPARγ)，研究发现，与正常饮食鼠相比，糖尿病鼠肾小球滤过率(glomerular filtration rate GFR)明显下降，肾脏血管抵抗增加，肾脏同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy)水平明显升高，肾小球MMP2水平升高，MMP9无明显变化，应用吡格列酮后，能改善肾小球MMP2 和Hcy的变化，故推测PPAR γ的损伤通过增加肾脏Hcy水平，降低NO水平从而增加了肾小球MMP2的活性，启动了肾脏功能不全。

    3    临床观察

    血MMP2、MMP9水平的变化可提供糖尿病血管病变的临床前期证据。Maxwell等［16］对43例肾功能正常的1型糖尿病患者血浆MMP2和 MMP9的研究发现，MMP2与正常对照组无明显差别，35%的糖尿病病人可检测到血浆MMP9，对照组均未检测到，但Shiau等［17］用ELISA和酶谱法两种方法检测201 例台湾1型糖尿病患者MMP2,MMP9蛋白水平和活性，发现1型糖尿病患者MMP2和MMP9的表达和活性明显升高，而且即使在糖尿病并发症发生之前，MMP2和MMP9的表达和活性已经升高。在对80 例2型糖尿病患者外周血MMP2、MMP9、TIMP1 等的研究中也发现血浆MMP2浓度是明显升高的［18］。最近，Derosa 等［19］对181例糖尿病患者进行研究发现血浆MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2水平均明显升高。糖尿病患者血基质金属蛋白酶水平的改变反映了细胞外基质代谢的异常。

    早年的一项研究对单纯2 型糖尿病患者连续观察4年，其中8例出现微量白蛋白尿，而血浆MMP9水平和正常白蛋白尿患者相比，在微量白蛋白尿出现之前即已升高，故认为MMP9参与了糖尿病肾病的发生发展，血浆MMP9可预测和早期诊断糖尿病肾病［20］。另外，在Tashiro等［21］的研究中发现，2型糖尿病肾病大量蛋白尿期的患者尿MMP9、Ⅳ型胶原水平明显升高，认为尿MMP9、Ⅳ型胶原检测有助于评价糖尿病患者肾脏损伤的程度。

    但Derosa 等［22］观察了25例儿童和青少年1型糖尿病患者，自诊断之日至随后的5年，研究MMP2、MMP9与糖尿病微血管并发症的相关性，发现糖尿病合并微血管并发症的患者MMP2表达水平和活性均明显升高，MMP9水平与无微血管并发症者无明显差别，推测MMP2可以作为糖尿病微血管并发症进展及严重程度的指标。Thrailkill等［23］对93例1型糖尿病患者的血浆、尿MMP2浓度和血浆MMP2活性及肾功能指标进行检测，发现T1DM患者血浆、尿MMP2浓度和血浆MMP2活性明显升高，而且尿MMP2浓度与与一些代表糖尿病及其并发症发病危险因素的临床参数相关，尤其是糖尿病肾病相关因素如高HbA1c、较长的病程、肾脏高滤过的证据、微量白蛋白尿的出现，推测尿MMP2是糖尿病肾脏病理损伤的较好指标。MMP9在大血管病变中研究更多，在糖尿病合并外周动脉疾病（peripheral artery disease，PAD）患者的研究中发现，糖尿病合并PAD者血浆MMP2和MMP9表达水平均升高，但MMP2的明胶酶活性与无PAD者比较无显著性差异，MMP9的明胶酶活性上升明显，提示MMP9是2型糖尿病血管病变进展的有效观察指标［24］。Tayebjee等［25］的研究也认为，血MMP9与大血管病变严重程度有关，认为血MMP9水平的上升反映了血管ECM积聚引起的蛋白水解活性的上升。

    总之，Ⅳ型胶原酶表达和活性的改变是影响肾脏Ⅳ型胶原及其它细胞外基质成分降解的主要因素，肾脏局部MMP2、MMP9活性的下降是ECM积聚的主要原因，外周血浓度的改变是MMPs与肾脏ECM及血管ECM积聚相互作用的结果。在糖尿病肾病中，纠正MMP2、MMP9表达和活性的异常，对于减少ECM积聚防止延缓肾小球硬化具有重要意义。目前的研究结论有一些矛盾之处，仍需开展进一步的研究，为早发现、早治疗糖尿病肾病提供新的思路。

 

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