中药复方六神丸中多类成分的多维液质系统筛查和鉴定
【摘要】 中药复方中成分复杂，通常包含不同类别的多种化合物。因此，建立无靶标的筛查和鉴定中药复方的分析模式是十分必要的。本研究采用液相色谱/飞行时间质谱(HPLC/TOFMS)和液相色谱/离子阱多级质谱(HPLC/Ion Trap MSn)的多维液质联用系统筛查和鉴定中药复方六神丸中的多类化学成分。在优化的液质条件下，飞行时间质谱对六神丸质谱信息中的每个色谱峰进行了精确分子量测定，并匹配出可能的化学组成；再结合离子阱质谱提供的多级碎片结构信息对其进行结构解析，最后采用相应的标准品进行确证。本研究共鉴定出六神丸中分别来源于蟾酥、麝香和牛黄三味药材的25种化合物，为复杂体系的多类别成分分析提供了一种有效、可靠的新模式。
【关键词】 多维液质联用，六神丸，系统筛查与鉴定，液相色谱/飞行时间质谱
1 引 言
中药复方复杂体系的成分分析, 是中药现代化研究的重要组成部分。以往中药复方成分鉴定主要采用色谱分离方法，从复杂体系中分离提取出单一化学成分，再通过核磁共振(NMR)、质谱(MS)等分析技术进行鉴定。这种方法通常需要经过复杂的分离、提取过程。因此，比较费时，并且往往是针对某一类化合物的鉴定，难以完整、系统地体现中药复方中多类别成分的复杂性。近年来，色／质联用技术如GC/MS[１,2]、CE/MS[3]、LC/MS及MS/MS (MSn)[4～6]等被越来越多地应用于中药复方分析中。其优点在于能够实现复杂成分的在线检测和鉴定。但由于中药复方缺乏标准品，单一的分析方法通常不足以系统地鉴定中药中的多类别复杂成分，迫切需要建立能够提供更多化学信息的分析方法。
中药复方六神丸在国内有着悠久的应用历史，其组方主要包括珍珠粉、牛黄、麝香、冰片、蟾酥、雄黄等多味名贵药材。六神丸的成分主要包括：蟾酥中的蟾酥二烯内酯类化合物和生物碱类化合物；牛黄中的胆酸类化合物；麝香和冰片中的挥发性成分；雄黄和珍珠中的矿物质成分。以往对六神丸质量控制的文献报道大多侧重于蟾酥二烯内酯类化合物的分析[7,8]，缺乏全面评价六神丸多类化学成分的方法。
本研究建立了一种无靶标系统筛查和鉴定复杂体系中多类别化学成分的多维液／质联用模式，共筛查、鉴定了六神丸中来自于不同药材的25种主要化合物。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1100 HPLC/TOFMS(Agilent Corp, Waldbronn, Germany)；1100 HPLC/MSD Trap(Agilent Corp, Santa Clara, CA, USA)；分析天平(0.0001 g/0.00001 g)，KQ500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); MS2型漩涡振荡器(广州IKA公司); R200型旋转蒸发仪(BUCHI Labortechnic AG, Flawill Switzerland)。色谱纯甲醇、乙腈(Fisher公司)；分析纯甲酸(北京第二化工厂)；MilliQ超纯水纯化系统，18 MΩ cm(Millipore公司)；羟基华蟾毒配基(cinobufotalin，SigmaAldrich公司)；蟾毒它灵(bufotalin，SigmaAldrich公司)；蟾毒灵(bufalin，DELTA天然有机化合物信息中心)；华蟾毒配基(cinobufagin，DELTA天然有机化合物信息中心)；脂蟾毒配基(resibufogenin，中国药品生物制品检定所)；睾酮(testosterone)、去氢睾酮(dehydrotestosterone, SigmaAldrich公司)；猪胆酸(hyocholic acid)、胆酸(cholic acid)、猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid)、去氧胆酸(deoxycholic acid)和鹅去氧胆酸(chendeoxycholic acid, SigmaAldrich化学公司)，其它标准品Ψ异沙蟾蜍精(Ψbufarenogin)、日蟾毒它灵(gamabufotalin)、沙蟾蜍精(arenobufagin)、远华蟾毒精(telocinobufagin)、去乙酰基华蟾毒配基(deacetylcinobufagin)、海蟾蜍精(marinobufagin)由北京大学果德安教授和上海交通大学张卫东教授惠赠(纯度均大于95%)；六神丸(041201)、蟾酥、牛黄、麝香由上海雷允上药业有限公司提供。六神丸、蟾酥、牛黄、麝香经研钵研成粉末，分别密闭保存。TOFMS校正液(G196985000，Agilent Corp, USA)。
2.2 色谱条件
2.2.1 HPLC/UV条件 Alltima反相C18(250 mm×4.6 mm i.d., 5.0 μm), 预柱Alltech RP18, (20 mm×3.9 mm)，柱温：30 ℃。梯度洗脱溶剂系统包括：(A)0.2%甲酸水溶液；(B)乙腈；初始梯度70%A和30%B，8 min时以线性梯度升至56%A和44%B，25 min时以线性梯度升至30%A和70%B；在梯度结束后用5%A和95％B冲洗5 min，然后回到初始梯度平衡10 min。进样体积：20 μL。
2.2.2 HPLC/MS条件 Ion Trap MSn实验条件：HPLC 条件如前所述，分流比设为3∶1。优化的实验条件为：正离子全扫描(ESI+)，自动记录三级总离子流图(TIC)，扫描质量范围50～1000 amu; 干燥气流速9 L/min，干燥气(N2)温度350 ℃，雾化气压0.242 MPa，毛细管电压3.5 kV，目标化合物m/z为500 amu，化合物稳定性为100％。TOFMS实验条件：HPLC 条件如前所述，分流比设为3∶1。采用双喷雾(dualspray)电离方式，内标液能随被分析物进入质谱中，提供实时质量数校准。优化实验条件为：电喷雾离子方式为正离子全扫描(ESI+)，扫描质量范围50～1000 amu；干燥气流速9 L/min，干燥气温度350 ℃，雾化气压0．２７６ ＭＰa，毛细管电压4.0 kV，碎裂电压215 V，锥孔电压60 V，八级杆DC1电压30 V，八级杆射频电压250 V。选择内标校准液中m/z 149.0233和922.0098离子做实时质量数校正。实验数据采用Analyst QS软件处理。每次测定样品之前，使用TOFMS校正液校准质量轴，以保证质量精度误差小于2×１０－６ s。
元素组成计算参数设定为： C≤ 50, H≤100, O≤ 10, N≤5；双键数0～50；电子状态：偶数； 带电个数： +1 ；容许范围：5×１０－６。TOFMS定性测定步骤：首先从总离子流TIC)中得到提取离子流图(XIC, ±0.25 Da)。通过扫描XIC峰的顶端得到精确离子流图(AMC)，然后计算该AMC峰的元素组成。
2.3 溶液配制
2.3.1 标准品溶液配制 准确称量1.00 mg的上述标准品，分别置于5 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并以甲醇定容，得到浓度为200 mg/L标准品储备液。进样前将标准品储备液用甲醇稀释10倍。
2.3.2 样品溶液配制 分别准确称取上述六神丸或药材粉末0.1 g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇4 mL，超声处理30 min，过滤，残渣加入3 mL甲醇，超声处理30 min，过滤，重复上步操作，合并滤液，用旋转蒸发仪回收甲醇得浸膏，浸膏用甲醇溶解，并转移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，0.22 μm滤膜过滤后作为供试品溶液。
2.4 六神丸中多类别成分的筛查和鉴定
六神丸的多维液质系统筛查和鉴定的步骤为：(1) 通过液相色谱/飞行时间质谱(HPLC/TOFMS)全扫描模式得到六神丸中主要色谱峰的精确分子量,并匹配出其可能的化学组成；(2)结合液相色谱/紫外检测器得到的吸收光谱和文献报道该中药复方中的可能化合物的分子量和元素组成,推断该化合物的类别或初步指认；(3)采用液相色谱/离子阱多级质谱(HPLC/Ion Trap MSn)分析得到该化合物的多极碎片信息，进一步推断化合物的结构；(4)通过有限的标准品确证鉴定结果。
3 结果与讨论
3.1 HPLC色谱分离结果
本研究的HPLC色谱采用了两段不同速率的梯度洗脱程序，该方法与文献[９]有相近之处，但是在流动相组成和梯度设计上与原有方法有所不同。本方法降低了酸度，选用0.2%甲酸水溶液，并且梯度变化更大，该洗脱程序可以保证在25 min内实现六神丸中4种类别化合物的较好分离，减少质谱分析中由于色谱峰共流出而产生的离子抑制。蟾酥二烯内酯类化合物的洗脱顺序与文献［１３］基本一致。
六神丸中的蟾酥二烯内酯类化合物和生物碱类化合物结构中含有共轭双键结构，具有较强的紫外吸收。由DAD(200～800 nm)扫描结果，得到蟾酥二烯内酯类的最大吸收波长约296 nm。麝香中雄激素类化合物和牛黄中胆酸类化合物紫外吸收较弱。在296 nm处的HPLC/UV色谱图如图1所示。
在样品分析之前，将蟾毒灵对照品直接注入质谱进行预实验。实验表明，TOFMS碎裂电压在分析过程中起关键作用。当碎裂电压高于225 V时产生的碎片增多，分子离子的灵敏度降低；当碎裂电压低于125 V，则碎片信息减少并且影响离子传输。因此在碎裂电压的选择上必须兼顾灵敏度和碎片信息。在本实验所选择的正碎裂电压下，主要被分析物都能得到较高丰度和较稳定的分子离子峰。
实验发现，六神丸中所含成分的浓度差异很大(2～4个数量级)，这将会影响到HPLC/TOFMS质谱数据的准确性。若峰的丰度高，则元素组成的误差将较大。解决的方法就是稀释之后再进样分析。
在电离方式的选择方面，在正离子扫描方式下可以得到蟾酥中的蟾酥二烯内脂类化合物、生物碱类化合物以及麝香中的雄激素类化合物和牛黄中的胆酸类化合物的多类别化学信息。因此，选择正离子扫描方式进行检测，总离子流图如图2所示。结合HPLC/UV和HPLC/MS(MSn)全扫面分析，可以较全面地反映六神丸中多类成分的化学信息。
3.2 六神丸中多类化学成分的筛查和鉴定结果
HPLC/TOFMS是理想的未知物筛查、鉴定和定量分析工具[1０]；液相色谱/离子阱多级质谱(HPLC/Ion Trap MSn)可以提供多级质谱碎片的m/z值，从而为未知化合物的鉴定提供结构信息[1１]。上述两种质谱方法的有机结合可以为复杂体系中的痕量和复杂化合物分析提供一种有效的途径。 图3 5HT和5HTQ碎裂方式图示通过HPLC/TOFMS分析，共鉴定了25个化合物（见表1和表2）。本研究中鉴定的25种化合物中有18种用标准品作了确认。根据25种化合物的来源，可将它们分成３组：(1)来源于蟾酥的蟾酥二烯内酯类化合物和生物碱类化合物；(2)来源于麝香的雄激素类化合物；(3)来源于牛黄的胆酸类化合物。
3.2.1 蟾酥中生物碱类化合物的筛查和鉴定 峰1和峰2的m/z值分别为219和177，经元素组成计算得到最匹配的化学式分别为C13H18N2O和C10H12N2O。依据它们在反相色谱系统中洗脱快的特点，推测是极性较大的生物碱类化合物。HPLC/Ion Trap MSn分析结果表明，它们在中性丢失分子量为59 Da和17 Da的中性碎片后，都得到m/z 160的碎片，由此推测峰1和峰2可能为同系物。结合文献［12］，比对元素组成和结构片段推测它们分别为N′,N′,N′trimethyl5hydroxytryptamine(5HTQ)和五羟色胺(5hydroxytryptamine, 5HT)。5HTQ和5HT在Ion Trap Msn中的碎裂方式如图3所示。经过与蟾酥提取液的紫外光谱和质谱数据对比，确认了这2种生物碱类化合物来源于六神丸中的蟾酥。
3.2.2 蟾酥中二烯内酯类化合物的筛查和鉴定 六神丸UV色谱图上除得到上述指认的1、2号峰之外，可以观察到大量的色谱峰，对UV色谱峰对应的TOFMS数据进行分析，得到这些峰的元素组成。经表1 六神丸中多类别成分HPLC/TOFMS鉴定结果
Dehydrotestosterone*289[M－H2O＋H]+253[M－2H2O＋H]+(100), 213[M－2H2O－40＋H]+(30) * 经过标准品确证(this identity was ultimately verified with pure standard)；括号中表示碎片的相对强度( proportion of relative abundance was included in the bracket)。过HPLC/Ion Trap MSn发现这些化合物有以下主要特征：①易中性丢失H2O；②易中性丢失CO；③易丢失分子量为96 Da的碎片。经过文献调研，甾体类化合物容易丢失侧链[1３,1４]，中性丢失96 Da的分子可能为蟾酥二烯内酯类化合物中性丢失甾环的C17位上的α吡喃酮侧链产生的[９]。蟾酥二烯内酯类化合物是蟾酥中的主要化学成分[1５,１６]。据文献报道，已经在蟾蜍或其它动物中发现100多种蟾酥二烯内酯类化合物[1７]。结合TOFMS和Ion Trap MSn的质谱数据，共鉴定了16种蟾酥二烯内酯类化合物，其中11种化合物通过标准品进行了确证。
3号峰的分子离子峰m/z值为417.2282，在417.2的提取离子色谱图得到3、5、6、20、21号峰5个同分异构体。其中3号峰和6号峰经标准品对照分别为Ψbufarenogin和Arenobufagin。5号峰碎片与3号峰完全一致，主要产生逐步中性丢失3个H2O和CO的碎片。推测5号峰可能为Ψbufarenogin的构象异构体Bufarenogin。20号峰的在多极质谱中容易脱去CO中性分子, 推测它可能具有C19上连接CHO的结构[9]，结合其元素构成推测为Hellebrigenin。在本研究的色谱条件下,各色谱峰的洗脱顺序与Ye等[9]对蟾酥二烯内酯类化合物分析的洗脱顺序一致。因此，推测21号峰可能为Deacetylcinobufotalin，这一初步鉴定结果在以后的体内代谢研究得到了证实，关于代谢研究结果将另文报道。
10号峰和23号峰m/z值分别为457.2220和399.2166，化学式分别为C26H33O7和C24H31O5。结合在HPLC/Ｉon Ｔrap MSn中的碎片特征，它们都容易脱去CO中性分子，推测它们可能具有在C19上连接CHO的结构[9]。此外，10号峰容易中性丢失42 Da的碎片，推测为中性丢失CH2CO。文献[17]报道，蟾酥中化学式为C26 H33 O7和C24 H31 O5的化合物分别为19oxocinobufagin和Resibufagin，结构与上述推测的结构信息一致。Resibufagin在六神丸中的含量较低，图4b更清晰的显示了它的色谱图。19oxocinobufagin碎裂过程示意图如图5所示。
图4 六神丸提取离子流图，其中(a)、(b)、(c)和(d)分别为m/z 401, 399, 289 和271 的提取离子流图
Fig.4 HPLC/TOFMS extracted ion chromatogram of Liushenwan, there of (a), (b), (c) and (d) show the extracted ion chromatogram in 401, 399, 289 and 271， respectively
色谱峰归属如表1和表2所示(the number of peaks marked is corresponding to Table 1 and Table 2).图5 19oxocinobufagin 在HPLC/Ｉon Ｔrap MSn中碎裂方式图示
Fig.5 Proposed fragmentation pathways of 19oxocinobufagin4号峰的分子离子峰m/z值为403.2489，提取离子流图表明7号是它的同分异构体，它们的元素组成相同，碎片相近，经过标准品对照分别为Gamabufotalin和Telocinobufagin。m/z值为 401.2322的同分异构体主要为8号峰和22号峰，它们的碎片相近，经过标准品对照分别为Deacetylcinobufagin和Marinobufagin，其中Marinobufagin与11号峰共流出，提取离子流图如图4a所示。9号峰、11号峰和16号峰除了产生脱去H2O和CO的碎片之外，还产生中性丢失42 Da的碎片，推测为中性丢失CH2CO，经标准品确证分别为蟾蜍它灵(bufotalin)、华蟾毒它灵(cinobufotalin)、华蟾毒配基(cinobufagin)。结合精确分子量和标准品对照，14号峰和17号峰分别被鉴定为蟾毒灵(bufalin)和脂蟾毒配基(resibufogenin)。
3.2.３ 牛黄中化合物的筛查和鉴定 猪胆酸(hyocholic acid，12号峰)、胆酸(cholic acid，13号峰)、猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid，15号峰)、去氧胆酸(deoxycholic acid，18号峰)和鹅去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，19号峰)按照上述多维液质联用方法进行鉴定，精密分子量如表1所示。在离子阱质谱中主要中性丢失H2O，没有对结构鉴定有意义的特征碎片，5种化合物均经过标准品进行鉴定。
3.2.４ 麝香中化合物的筛查和鉴定 峰24和峰25均为共流出峰，TOFMS提取离子流图如图4c和4d所示，计算化学式相同，均为C19H29O2。这两个物质在TOFMS中经CID碎裂后，脱水离子峰[M＋H－18]+丰度很高，其中25号峰主要以脱水的离子峰存在。在HPLC/Ｉon Ｔrap MSn中的碎裂过程主要为中性丢失H2O。通过分析蟾酥提取液、牛黄提取液和麝香提取液证实峰24和峰25来自于麝香。文献[16]报道了麝香中多种成分的质谱数据，依据元素组成推测可能为雄激素类化合物睾酮和脱氢表雄酮，标准品分析确证了上述推测。值得注意的是，在六神丸中发现了睾酮和双氢表雄酮。以往对六神丸的质量控制中未对这两种化合物进行控制[7,8]，本研究为建立全面的六神丸质量评价标准提供了参考。
【参考文献】
1 Zhang H, Hu Y, Liu C X, Li C P, Wang H F, Yuan J S, Tang K L, Xu J W. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 43(1): 151～157
２ Deng C H, Yao N, Wang A Q, Zhang X M. Analytical Chimica Acta, 2005, 536(1/2): 237～244
3 Yang XiuＬing(杨秀岭), Zhang LanＴong(张兰桐), Yuan ZhiＦang(袁志芳). China Pharmacy(中国药房), 2006, 17(1): 62～64
４ Zhang J, Tao D Ｙ, Duan J Ｃ, Liang Z, Zhang W Ｂ, Zhang L Ｈ, Huo Y Ｓ, Zhang Y Ｋ. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2006, 386(3): 586～593
５ Luo GuoＡn(罗国安), Wang YiＭing(王义明), Dai DeＳhun(戴德舜), Wu FangＹong(伍方勇). Chemical Research in Chinese Universities(高等学校化学学报), 2002, 23(9): 1698～1700
６ Guo F Ｑ, Li A Ｈ, Lan F, Liang Y Ｚ, Chen B Ｍ. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 40(3): 623～630
７ Hong Z, Chan K, Yeung H. W. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1992, 44(12): 1023～1026
８ Su YongＨua(苏永华), Huang XueＱiang(黄雪强), Zhang DaＺhi(张大志), Zhang YaＮi(张亚妮), Xie JueＭin(谢觉民), Ling ChangＱuan(凌昌全). Chinese Traditional Patent Medicine(中成药), 2003, 25(1): 24～27
９ Ye Ｍ, Guo Ｄ Ａ． Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2005, 19: 1881～1892
1０ Thurman Ｅ Ｍ, Ferrer Ｉ, Fern′andezAlba Ａ Ｒ． J. Chromatogr. A， 2005, 1067 (1／2): 127～134
1１ Ferrer Ｉ, Furlong Ｅ Ｔ． Environ. Sci. Technol.， 2001, 35: 2583～2588
1２ McClean Ｓt, Robinson R C, Shaw C, Smyth W F. Rapid Commun. Mass Spectrom， 2002, 16: 346～354
1３ Arthur K E, Wolff J C, Carrier D J. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2004: 18: 678～684
1４ Wong S K, Tsui S K, Kwan S Y. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2002, 30: 161～166
1５ Krenn L, Kopp B． Phytochemistry， 1998, 48: 1～29
１６ Steyn P S, van Heerden F R． Nat. Prod. Rep.， 1998, 15: 397～413
1７ Krenn Ｌ， Kopp Ｂ． Phytochemistry， 1998, 48(1): 1～29
订阅登记：
请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息，感谢您浏览首席医学网！