罗格列酮对兔动脉粥样硬化心血管系统超微结构的影响
【摘要】 目的 观察罗格列酮对兔动脉粥样硬化(AS)的心血管系统保护作用。方法 大耳白兔37只，随机分为空白对照组、AS组和罗格列酮组，空白对照组饲喂普通饲料，其余组给与高脂饮食，罗格列酮组饲料中加入罗格列酮，应用电镜观察三组内皮细胞、平滑肌细胞等结构。结果 AS兔主动脉、颈动脉的动脉壁内膜等很多异常部分，经罗格列酮治疗后，得到显著改善。结论 罗格列酮对兔AS模型心血管系统超微结构的异常有纠正或改善作用。
【关键词】 罗格列酮;动脉粥样硬化;心血管系统；形态学；兔
目前发现动脉粥样硬化(AS)性心、脑并发症已经向中年甚至是年轻人群发展。既往认为其发病机制与脂代谢紊乱、内皮功能障碍、炎症、遗传因素有关。自1988年Reaven〔1〕提出胰岛素抵抗（IR）的概念后，IR与心脑血管疾病的密切关系已经日益受到重视。罗格列酮针对IR起作用，临床降血糖效果肯定。目前国内外对罗格列酮与冠状动脉粥样硬化关系的研究不多，我们曾经报道罗格列酮对自发性高血压大鼠有很强的降压作用，而且对主动脉壁内膜层、平滑肌层出现的异常改变,有抑制或纠正作用〔2，3〕。本研究旨在进一步明确罗格列酮是否对粥样硬化斑块有明显的消退作用。
1 材料与方法
1.1 动物
动物选购自吉林大学基础医学院实验动物中心，雄性日本大耳白兔37只，7～8周龄，体重（1.98±0.16） kg。
1.2 方法
随机将动物分为3组，空白对照组（9只）、AS组（12只）、罗格列酮组（16只），各组兔均单笼饲养，空白对照组饲予普通饲料（吉林大学基础医学院实验动物中心）；AS组给予高脂饮食（1%胆固醇，14%蛋黄粉,5%猪油）120～150 ｇ/ｄ；罗格列酮组给予高脂饲料，并将罗格列酮混在第一口饲料，剂量平均为1.5 mg/kg（马来酸罗格列酮片，葛兰素史克公司，批号：05010038）。第1天一次性给予AS组及罗格列酮组兔由耳缘静脉缓慢注射牛血清白蛋白1 g/kg，空白对照组静脉注射等量生理盐水。实验前1 w对动物进行适应性喂养，每周测定饮食量，每2 w测量全部兔体重一次，观察兔的活动、进食及皮毛状态，实验期共14 w。
1.3 标本的采集和检测
于第14周处死动物，剥离主动脉和颈动脉,将标本组织切成小块,置于2.5%戊二醛+0.1 mol/L磷酸缓冲液中固定2 h。1%锇酸+0.1 mol/L 磷酸缓冲液后固定2 h，逐级丙酮脱水，PON812包埋。用LKB-V型超薄切片机先切1 mm半薄切片,甲苯胺蓝染色,光镜观察定位,再进行超薄切片。最后对超薄切片进行醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色，JEM-1200EX型透射电镜观察、摄片。
1.4 统计学处理
采用统计软件SPSS10.0对实验数据进行检验，各组计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 一般指标和血脂情况
从实验第6周起AS组及罗格列酮组动物进食量减少，日常活动减少，AS组平均胆固醇(TC)摄入量较罗格列酮组减少。表1 各组胆固醇摄入量及血脂结果(略)
2.2 各组电镜检查结果
电镜下见：空白对照组内皮细胞扁平完整，相邻内皮细胞连接紧密，细胞核无碎裂，内弹力膜平直、均匀，未见明显脂质空泡及胶原纤维增生；AS组主动脉内皮细胞尚完整，内弹力膜不明显，内皮下可见大量脂质空泡，平滑肌细胞胞浆含较多脂质，胶原纤维增生，管壁结构紊乱；颈动脉内皮细胞尚完整，内皮下可见较多胶原纤维沉积，内皮细胞可见少量脂质；罗格列酮组主动脉内皮细胞完整，核椭圆形，内皮下可见胶原纤维沉积及少量脂质空泡；颈动脉内皮细胞完整，核椭圆形，染色质无边聚，内皮下未见脂质沉着（图1）。
3 讨 论
牛血清是一种大分子异种蛋白，注射入白兔体内后形成免疫复合物，可被吞噬细胞吞噬，刺激分泌炎症因子，如IL-1、TNF-α等。炎症因子在AS发病中起到重要作用，而且使血管通透性增加，内皮间距增加，使免疫复合物更易于沉积在血管壁深层。另外，免疫复合物能激活补体，被免疫复合物附着的血管内皮受到攻击，并能够释放趋化因子，促进中性粒细胞浸润，造成血管壁损伤，血小板聚集于暴露的胶原，活化形成微血栓，受损的内皮细胞可分泌多种黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)，血液中的单核-吞噬细胞受到趋化作用,进入血管壁内，吞噬了大量脂质并沉积在细胞内形成泡沫细胞，启动AS的病理改变。而且血管内皮细胞能够分泌NO和ET，是一对重要的相互拮抗物质，正常情况下二者的分泌处于平衡状态，如果出现比例失衡，也将导致内皮损伤。而且复合物被吞噬后不易被消化，形成自身免疫性血管炎〔4〕，上述损伤机制为一个持续的慢性炎症过程，构成AS重要的发病机制之一。
注射血清后饲喂白兔高脂饮食有助于粥样硬化斑块的形成，主要理论为血脂紊乱学说。高脂血症容易导致血液黏滞、流速减慢，易于血栓的形成，易于VLDL-C、乳糜微粒和LDL在血管内皮的黏附沉积。oxLDL-C半衰期长，较其他成分更加容易沉积，而且它致AS作用强，能引起单核细胞聚集。HDL-C〔5〕是重要的抗AS因子，它能够逆转TC的转运，阻止脂质进入血管壁内，减少TC在血管壁沉积，抑制LDL 氧化，阻止巨噬细胞进入内皮下间隙，巨噬细胞上存在“修饰的VLDL受体”，能吞噬脂质形成泡沫细胞，故HDL-C能减少巨噬细胞转变为泡沫细胞的机会。另外，有实验表明含甘油三酯(TG)的脂蛋白溶解产物对内皮细胞也有损伤作用。故应用牛血清加高脂饮食能成功的造出AS模型。
罗格列酮应用于临床已十余年，能显著降低血糖，延缓2型糖尿病并发症的进展。罗格列酮的靶分子为过氧化酶增殖体活化受体(PPARγ)，PPARγ属于核受体超家族，目前研究发现它在脂肪细胞分化、糖代谢、脂代谢及炎性反应有重要作用，但是对于其抗AS的研究不多。
Gaikwad等人研究发现罗格列酮能降低IR大鼠血糖、血浆胰岛素及TC水平〔6〕。本研究发现，相对空白对照组，AS组及罗格列酮组血脂明显升高,罗格列酮组能降低TC、TG、VLDL，虽然未达到显著统计学水平，但是考虑到TC摄入水平的差异，罗格列酮降脂作用在本研究中很明显，并明显提高HDL含量。罗格列酮通过PPARγ的作用使脂肪组织蛋白脂酶表达增加,加速TG的分解,减少血清中TG水平。国内外研究表明罗格列酮还能够增加骨骼肌对脂肪酸和TG的摄取〔7〕，降低IR动物血糖、血浆胰岛素和TC水平〔8〕。
我们曾报道AS白兔，光镜下可见主动脉、颈动脉大量的泡沫细胞形成粥样斑块，经罗格列酮治疗后斑块面积明显减小〔9〕。本次电镜主要观察主动脉及颈动脉，因为AS主要累及大中型弹力动脉。观察发现AS组存在主动脉及颈动脉内皮下脂质沉积增加，平滑肌细胞胞浆含较多脂质等情况；主动脉组平滑肌周围可见大量胶原纤维增多，颈动脉内皮下同样可见较多胶原纤维沉积现象。血管平滑肌胶原纤维增生和大量脂质沉积，形成纤维斑块，符合AS特点，是导致管壁狭窄，斑块内出血、破裂，直至闭塞的病理基础。本研究观察到AS这些异常表现在经过罗格列酮治疗后有明显好转。
考虑罗格列酮抗AS机制除了上述对血脂紊乱的调节作用外可能由于它能改善循环内炎症因子水平，减少金属蛋白酶-9的分泌，改善血管内皮功能。血管内皮结构和功能的正常是维持血管平滑和血液畅通的基础，罗格列酮能诱导一种新的内皮源性血管舒张肽——C型利钠肽，减少内皮素的释放,扩张血管，通过激活AMPK防止由于NAD(P)H 导致的氧化应激作用。另外，长链酰基辅酶A合成酶（ACSL-4）表达使血管内皮细胞产生AS，罗格列酮能阻止ACSL激活和分隔动脉平滑肌细胞和巨噬细胞〔8〕，从而减少泡沫细胞的生成，减轻动脉粥样斑块。
总之，本研究成功的建立了AS模型，并且发现AS模型大动脉的很多异常表现经过罗格列酮治疗后有明显的改善和纠正，说明罗格列酮可能对AS的超微损伤有治疗作用，具有心血管保护作用，具体应用于临床还有待今后进一步的研究。
【参考文献】
1 Reaven GM.Banting lecture 1988.Role of insulin resistance in human disease〔J〕.Diabetes，1988；37 (12)：1595-607.
2 孔 俭，姜宏宇，荣爱红.罗格列酮对高血压大鼠主动脉壁保护作用的形态学研究〔J〕.中国老年学杂志，2005；25（4）：416-8.
3 孔 俭，孙 捷，汲宏磊.罗格列酮对自发性高血压大鼠的降压作用〔J〕.中国高血压杂志，2003；11（5）：454-6.
4 康 闽，韦卫中，王宏伟.免疫性血管炎致动脉粥样硬化的实验研究〔J〕.实用儿科临床杂志，2003；18（3）:166-8.
5 程歆琦.代谢综合征与血脂异常〔J〕.国外医学·临床生物化学与检验学分册，2005；26（2）：77-9.
6 Gaikwad AB，Viswanad B，Ramarao P.PPAR gamma agonists partially restores hyperglycemia induced aggravation of vascular dysfunction to angiotensin II in thoracic aorta isolated from rats with insulin resistance〔J〕.Pharmacol Res,2007；55(5):400-7.
7 Todd MK,Watt MJ,Le J,et al.Thiazolidinediones enhance skeletal muscle triacylglycerol synthesis while protecting against fatty acid-induced inflammation and insulin resistance〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2007；292(2):E485-93.
8 Askari B，Kanter JE，Sherrid AM,et al.Rosiglitazone inhibits acyl-CoA synthetase activity and fatty acid partitioning to diacylglycerol and triacylglycerol via a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-independent mechanism in human arterial smooth muscle cells and macrophages〔J〕.Diabetes,2007；56(4):1143-52.
9 王萍萍，邵明柏，王新莉.罗格列酮对兔血脂紊乱及动脉脂质沉积的影响〔J〕.中国老年学杂志，2007；27（6）：537-9.
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