急性缺血与L精氨酸干预对大鼠心肌组织一氧化氮合酶基因表达的影响
【摘要】 目的 观察急性心肌缺血状态下大鼠心脏内皮型和诱生型两种一氧化氮合酶表达和左旋精氨酸（LArg）对大鼠心脏组织内生型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响。方法 60只健康成年SD大鼠随机分为假手术组、缺血组两组。分别取1、2、8、24 h四个不同时间点。采用开胸结扎冠状动脉左前降支的方法建立心肌缺血模型，用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）检测大鼠心梗后不同时间点及LArg（30 mg·kg-1·次-1×3）给药后缺血心肌eNOS mRNA表达；免疫组织化学方法检测冠脉结扎后8 h缺血心肌诱生型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白。结果 ①冠脉结扎后2h缺血组大鼠缺血心肌组织eNOS mRNA表达下降(P＜0.05)，并持续至结扎后24 h；梗死后24 h组eNOS mRNA表达与结扎后2 h组相比无显著性差异（P＞0.05）。②与生理盐水组相比，LArg静脉注射可增加冠脉结扎后大鼠缺血心肌组织细胞eNOS mRNA表达(P＜0.05)。 ③冠脉结扎后8 h，梗死及周围区存活心肌组织细胞出现大量iNOS蛋白表达，而假手术组未见iNOS蛋白表达。结论 ①正常心肌组织有eNOS基因表达，无iNOS蛋白表达；心肌急性缺血刺激早期诱导大鼠缺血心肌细胞iNOS蛋白大量表达。②在心梗早期缺血心肌组织细胞eNOS基因表达减少。③LArg静脉用药可增加急性心肌梗死大鼠缺血心肌组织细胞eNOS mRNA表达。
【关键词】 心肌梗死；一氧化氮合酶；大鼠；L精氨酸
在生物体内，一氧化氮合酶（NOS）催化LArg向瓜氨酸转化，并产生一氧化氮（NO）。NO合成有两种类型的同功酶，原生型和诱生型。原生型最初在脑内发现，包括神经型（ncNOS，或称NOSⅠ）和内皮型（eNOS，或称NOSⅢ），受钙调蛋白（CaM）可逆性调节，在Ca2+等因素作用下以纳摩尔水平调节NO的产生。心血管系统的eNOS主要分布于内皮细胞和心肌细胞。诱生型一氧化氮合酶（iNOS，NOSⅡ）在细胞因子和细菌内毒素刺激等病理状态下释放，不受钙浓度影响，在微摩尔水平增加NO。NO的生理功能是通过eNOS催化产生而发挥作用的〔1～3〕。据报道NO供体LArg可缩小心肌梗死面积，改善缺血后心肌及缺血再灌注后内皮的功能恢复〔3～5〕。但研究同时显示缺血再灌注中NO生成对心肌功能有损害作用，NOS抑制剂缩小心梗面积、改善缺血再灌注后大鼠的心功能〔6〕。这些明显分歧的结果提示：在不同的实验条件中一氧化氮产生速率不同和不同类型的NOS产生活性作用不同。本次研究通过结扎大鼠冠状动脉左前降支建立心肌缺血模型，检测急性心梗后大鼠心脏组织内皮型、诱生型两种一氧化氮合酶的变化，并观察一氧化氮前体ＬＡrg用药对心梗大鼠心肌eNOS基因表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康成年SD大鼠60只，雌雄不拘，体重200～250 g，5月龄，由广州医学院动物实验中心提供。
1.2 实验仪器
小动物人工呼吸机：DH150型，浙江大学医疗仪器设备厂生产；RM6200型多道生理记录仪：上海医疗仪器厂；紫外光分光光度计：Bekman DU 530；DNA合成仪：Bekman公司480型；凝胶成像系统：UVITECDBT08。
1.3 试剂及耗品
TRIzol试剂，Gibco公司；特异性eNOS和βactin引物，DL2000 Marker，大连宝生物公司合成提供；SuperScriptonestep试剂盒,美国Gibco公司；LArg，广州威佳生物试剂公司提供；兔抗鼠iNOS多克隆抗体，Chemicon公司；ABC Kit，Vector laboratories Inc；DAB显色试剂盒，福州迈新生物公司；其余耗品均为国产分析纯。
1.4 动物手术和冠状动脉结扎法
动物模型按我们先前的实验方法〔7〕进行。实验动物用10%水合氯醛(2～3 ml/kg ip)麻醉，仰卧位固定.颈部手术,行动物气管插管，连接小动物呼吸机，呼吸机参数∶呼吸比1∶3，通气频率50～60次/min，潮气量7～10 ml。左胸第Ⅳ、Ⅴ肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，在以无损伤缝针结扎左冠状动脉前降支。采用标准肢体导联记录大鼠心电信号,经LMS4B型四道生理记录仪放大后标记，用示波器作连续心电临护,结扎后心电图上出现ST段抬高及心肌局部出现紫绀表示缺血成功。术后逐层缝合关闭胸腔。假手术组处理同前，但不结扎冠状动脉左前降支。
1.5 实验分组、给药方法及途径
动物随机分为两大组，假手术组与心肌缺血实验组各30只。两组分别取术后1、2、8、24 h四个不同时间点各6只。术后8 h取材用于心肌切片制作,1、2、24 h取材用于心肌组织RNA提取。另有12只均分为LArg治疗组和生理盐水对照组各6只在术后24 h取材。LArg用药组注射30 mg·kg-1·次-1〔8〕，溶于0.25 ml生理盐水中,术前1 d和术前1/2 h由尾静脉各注射一次，术后1/2 h再注射一次；生理盐水对照组给药剂量、方法及途径同用药组。
1.6 RTPCR检测心肌eNOS mRNA表达量
①总RNA的提取。留取100 mg梗死及梗死周围区域心肌组织，用TRIzol试剂（Gibco公司）提取总RNA后，以紫外光分光光度计（Beckman DU 530）测定其浓度和纯度：样品总RNA浓度根据核酸稀释倍数计算；所用RNA纯度：其OD260/OD280均在1.8～2.0之间。②引物。内标使用Gibco公司提供的大鼠βactin寡聚核苷酸序列：上游5′TACAACCTCCTTGCAGCTCC3′，下游5′GGATCTTCATGAGGTAGTCATTC3′，可扩增出长度为650 bp的βactin cDNA片段；eNOS寡聚核苷酸引物序列根据Nadaud等文献中所列〔8〕，我们设计如下：上游 5′CCGGCTGCCACCTGATCCTA3′，下游 5′AACATGTGTCCTTGCTCGAGGCA3′。可扩增出长度为340 bp (+268～+568 bp)的eNOS cDNA片段。③RTPCR。取同一样品总RNA各1 μg，参照我们先前的方法〔7〕分别用50 pmol特异性eNOS和βactin引物，采用SuperScriptonestep试剂盒（美国Gibco公司）以一管法进行RTPCR，进行 eNOS、βactin相应片段的扩增。④RTPCR产物的检测和分析。取RTPCR产物15 μl于2.0%琼脂糖凝胶上电泳80 v 60 min，凝胶成像系统（UVITECDBT08）拍摄实验结果，电泳条带用URV计算机图像分析软件扫描分析。测定特异性条带的辉度和面积,以各自的辉度与面积的乘积表示cDNA的量,再以同一RTPCR反应体系中的iNOS cDNA/βactin cDNA量的比值表示iNOSmRNA的相对强度。
1.7 免疫组织化学（ABC法）检测心肌iNOS蛋白
动物于结扎后8 h脱臼处死，经固定(4%多聚甲醛)、脱水后行冰冻切片，染色前以正常马血清封闭切片，使用兔抗鼠多克隆iNOS第一抗体(稀释度1∶500)，按ABC试剂盒说明进行免疫组化步骤，DAB显色，苏木素复染核，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。显微镜下观察，阳性结果为胞浆呈现棕黄色颗粒。阴性对照：以PBS代替第一抗体。
1.8 统计学处理
数据用x±s表示，多组间比较用单因素方差分析(one wayANOVA)，不同时段的组间比较用q检验。
2 结 果
2.1 大鼠急性心肌梗死后早期不同时间心肌组织eNOS mRNA的表达
冠脉结扎后1 h，与假手术组相比，缺血组大鼠梗死及周围区域心肌组织中eNOS mRNA表达无明显变化；结扎后2 h时检测到缺血组大鼠梗死及周围区域心肌组织eNOS mRNA表达下降（P＜0.05），eNOS mRNA表达降低持续至结扎后24 h；梗死后24 h组eNOS mRNA表达与结扎后2 h组相比无显著性差异（P＞0.05）。见表1、图1。表1 急性心梗后不同时间大鼠心脏eNOS mRNA表达量的变化（略)
2.2 LArg用药对心肌组织eNOS基因表达的影响
大鼠心梗前后予LArg治疗的结果显示:：LArg用药组大鼠梗死及周围区心肌组织eNOS ｍRNA水平升高，与生理盐水对照组相比有显著性差异(P＜0.05) (见图2)，LArg用药增加心梗大鼠梗死及周围区心肌组织eNOS基因表达。
2.3 心梗后8 h心肌组织iNOS蛋白表达
免疫组化染色显示，在大鼠冠脉结扎后8 h，梗死及周围区心肌细胞胞浆出现大量iNOS蛋白表达；而假手术组大鼠心肌组织细胞胞浆则未见iNOS蛋白颗粒(图3)。
3 讨 论
作为NO生成的同功酶，心血管系统内eNOS和iNOS活性、合成的变化直接影响到心血管疾病的发生发展。由eNOS催化分泌的NO，不仅通过影响循环系统生理功能引起系统性血管舒张，进而减少了心脏的前后负荷而保护心肌；其对心肌的直接影响，主要是促进心室肌舒张，增强心室肌的扩张效应来保持心输出量，对生理和病理状态下的心脏泵血均有益〔1，2，6〕。而我们的实验结果显示，由于受心梗后心肌细胞和微血管内皮功能受损等因素影响，在心梗早期缺血心脏即有eNOS基因表达减少。不同时间点eNOS mRNA的表达规律是：结扎2 h缺血组大鼠梗死及梗死周围区域心肌组织eNOSmRNA表达下降，其表达丰度降低一直持续至结扎后24 h；而在大鼠冠脉急性阻断后24 h予左LArg投药增加其心肌组织eNOS基因表达。由此看来，纠治eNOS基因表达减少、使用增强eNOS的活性和合成的药物和生物制剂可有效治疗心肌缺血和心功能不全，有深入研究的价值。
国外研究报道：L精氨酸投药（1 mmol/L）加强和保持缺血再灌注损伤大鼠心脏的Ca2+依赖性NOS（eNOS）活性，经NO通路介导、Ca2+依赖性NOS敏感途径（NOS抑制剂LNNA可阻断其效应），减轻心功能不良、发挥心肌保护作用〔3，4〕，进一步证实了eNOS在缺血心脏中维护心功能的有益作用和L精氨酸的治疗作用。本结果表明，与生理盐水对照组相比，30 mg·ｋｇ-1·次-1的LArg增加心梗后大鼠缺血心肌组织eNOS基因的表达，LArg增强eNOS活性有诱导eNOS mRNA在细胞内表达这一途径的参与，亦间接证实了及时补充LArg治疗心肌缺血是有益的。心肌缺血时冠脉内皮功能失调可以血管加入LArg孵育而恢复功能〔9〕，说明缺血病理状态下有内源性LArg排空或NOS动力学受抑制，提示LArg治疗的必要性和有益性。
心血管系统中包括血管内皮、心内膜、心肌和血管平滑肌细胞均存在胞浆分泌型酶蛋白iNOS〔9，10〕。多数作者认为iNOS在正常情况下量微或不出现，只有某些病理情况下才呈诱导性表达。我们的实验检测到急性心肌缺血大鼠心肌细胞胞浆中出现大量iNOS蛋白，但并未检测到假手术组大鼠心肌细胞有iNOS蛋白出现，与文献〔11〕报道一致。我们先前的研究曾用RTPCR方法，从基因水平检测到急性冠脉阻断后不同时间点iNOS mRNA表达规律是：心肌梗死后4 h始iNOS mRNA表达开始升高，于8 h到达最高峰，24 h回落〔7〕。本次实验我们在前期研究的基础上，于冠脉结扎后8 h取材，检测到急性心肌缺血后8 h大鼠心脏组织细胞iNOS高表达，进一步从蛋白水平证实了急性心肌缺血性损伤诱导心肌细胞iNOS生成的作用。
目前对iNOS基因表达过度可造成心肌免疫性损伤是比较肯定的。高表达的iNOS除直接损伤大分子DNA，还诱导心肌细胞的凋亡，造成心功能破坏。使用高度选择的iNOS抑制剂SMT治疗冠脉结扎后急性心梗大鼠，亦证实有针对地抑制iNOS表达可减少心肌细胞丧失，明显缩小心梗面积〔12〕。这可能成为将来治疗心脏疾病，包括心肌梗死的一种新策略。
【参考文献】
1 Luiking YC，Hallemeesch MM,Lamers WH,et al.NOS3 is involved in the increased protein and arginine metabolic response in muscle during early endotoxemia in mice〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005;288(6):E125864.
2 Kim YK，Suarez J，Hu Y,et al.Deletion of the inducible 70kDa heat shock protein genes in mice impairs cardiac contractile function and calcium handling associated with hypertrophy〔J〕.Circulation，2006;113(22):258997.
3 Martina V,Masha A，Gigliardi VR,et al.Long Term NAcetylcysteine and LArginine administration reduces endothelial activation and systolic blood pressure in hypertensive patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Diabetes Care，2008;2(11):1108.
4 Bryan NS，Calyert JW，Elrod JW，et al.Dietary nitrite supplementation protects against myocardial ischemiareperfusion injury〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(48):191449.
5 Liu X,Huang Y，Pokreisz P,et al.Nitric oxide inhalation improves microvascular flow and decreases infarction size after myocardial ischemia and reperfusion〔J〕.J Am Coll Cardiol，2007;50(8):80817.
6 Chen LL，Yin H，Huang J.Inhibition of TGFbeta1 signaling by eNOS gene transfer improves ventricular remodeling after myocardial infarction through angiogenesis and reduction of apoptosis〔J〕.Cardiovasc Pathol，2007;16(4):22130.
7 陆东风，覃 军.诱生型一氧化氮合酶基因在心肌梗死大鼠中的表达〔J〕.广州医学院学报,2003；31(3)：557.
8 Nadaud S，Philippe M，Arnal JF,et al.Sustained increase in aortic endothelial nitric oxide synthase expression in vivo in a model of chronic high blood flow〔J〕.Circ Res，1996；79:85763.
9 Gigante B，Morlino G，Gentile MT，et al.Plgf/eNos/ mice show defective angiogenesis associated with increased oxidative stress in response to tissue ischemia〔J〕.FASEB J，2006；20（7）：9702.
10 Ohashi K，Kihara S，Ouchi N,et al.Adiponectin replenishment ameliorates obesityrelated hypertension〔J〕.Hypertension，2006;47(6):110816.
11 Poon BY，Eko Raharjo，MSc，et al.Complexity of inducible nitric oxide synthase〔J〕.Circulation，2003；108（10）:10810.
12 Paulus WJ.The role of nitric oxide in the failing heart〔J〕.Heart Fail Rev，2003；6(2)：10518.
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