双水相萃取法从风干香肠中分离提取蛋白酶
【摘要】 双水相萃取(ATPS)是近年来发展起来的蛋白纯化方法。为了扩展该方法适应领域，同时为风干香肠形成过程酶系的研究提供具体方法。本实验研究了运用双水相技术分离提取风干香肠中蛋白酶，对构成双水相体系中的PEG分子量、浓度和类型以及盐浓度的影响进行了分析。确定了双水相组成体系为20% PEG1000（m/m）和25% MgSO4（m/m），在此体系中风干香肠的蛋白酶主要分布在上相，最高酶活12.37 U/μg；纯化倍数为4.61；回收率为85%。通过分子筛层析对比，表明风干香肠经过双水相分离提取杂蛋白峰被除去，而蛋白酶峰几乎未受到影响，说明该双水相体系萃取香肠中蛋白酶具有良好的专一性。调解双水相pH值对蛋白酶的萃取没有影响，而添加电解质NaCl反而产生不利影响。
【关键词】 双水相 蛋白酶 风干香肠 分离提取
Purification of Ｐrotease from Ｄry Ｆermented Ｓausages by Ａqueous Ｔwophase System
ZHANG LanWei, CHEN Yi, HAN Xue, Du Ming1, YＩ HuaＸi
１(College of Food Science and Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090)
2(Food Science College, Northeast Agricultural University, Harbin 150030)
Abstract Aqueous twophase system (ATPS) was used in the purification of proteins in recent years. It was widely used for extracting the bioactive substances. In order to extend the application for analyzing the forming of enzymes in the dry fermented sausages, the protease was extracted from dry fermented sausages by an ATPS. The phase compositions including polyethylene glyool (PEG) molecular mass, concentration as well as types and concentration of salts affected protein partitioning were studied. ATPS comprising PEG1000 (20%, m/m) and magnesium sulfate (25%, m/m) provided the best condition for the maximum partitioning of the protease into the top phase and gave a highest specific activity(12.37 U/μg protein) and purification fold(4.61).The yield of 85% was obtained. When Sephadex G75 was used, it revealed that the band intensity of contaminating proteins in ATPS fraction almost disappeared and the band intensity of major protease slightly decreased. Therefore, ATPS was an effective method for partitioning and recovery of proteases from dry fermented sausages. Adjusted the pH in ATPS, there was no effect on protease extraction, while adding electrolyte has disadvantage effect.
Keywords Twophase system, proteases, dry fermented sausage, extraction and purification
本文系黑龙江省教育厅科技攻关项目(No.10511Z003)和黑龙江省十五科技攻关项目（No.GB02B40311）资助
* Email: zhanglw@hit.edu.cn
1 引 言
蛋白酶可作用于蛋白质或多肽肽键，对食品质量、风味、改善食品的营养起重要作用。获得纯化的蛋白酶的主要方法有：盐析法、专一性沉淀法和变性方法。但这几种方法只能得到蛋白酶的粗制品，电泳法虽然可以获得高纯度蛋白，但它易破坏蛋白质的生物活性。双水相萃取(ATPS) 技术是近年来发展起来的一项蛋白纯化方法。该方法是利用一种聚合物和无机盐的混合溶液或两种水溶性不同的聚合物，在一定浓度下体系分成互不相容的两相，由于表面性质、电荷间及各种作用力（如憎水键、氢键和离子键）等因素的影响，使得目标蛋白质和其它蛋白质在两相间的分配系数不同，达到分离目的[1,2]。近年来，对离子型和非离子型表面活性剂双水相、表面活性剂/无机盐双水相的成相机理、界面性质、相行为以及蛋白质在体系中的分配行为进行了深入的研究。随着新型双水相体系的发现，该方法获得的产物活性高，已广泛应用于生物化工、医药化学、细胞生物学等领域[3,4]，牛血清蛋白(BSA)、牛酪蛋白、β乳球蛋白、血清蛋白、α淀粉酶和蛋白酶、胆固醇氧化酶、脂肪酶、磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、葡糖淀粉酶等都在双水相体系中得到较好的分离，将有希望在工业化生产中得到应用[5]。但由于不同蛋白酶本身特性及所存在的环境差别，而双水相的组成又直接影响着目标酶分配系数、提取纯度和回收率[6～10]，因此该方法在食品领域的相关研究还很少。
风干香肠在加工过程中因复杂的生物化学反应而形成独特风味，其中蛋白酶引起蛋白质降解产生风味前体——游离氨基酸是风味形成的关键[１１，12]。对于风干香肠中蛋白酶的研究，主要是通过香肠发酵和成熟过程中氨基酸成分的变化和产物的形成来反推其作用。本实验采用双水相萃取技术从风干香肠中提取蛋白酶，通过对成相物质的组成、浓度、pH值、无机盐等影响因素的考察，建立一种简单可行的分离提取风干香肠中蛋白酶的方法，为研究风干香肠蛋白酶的作用提供有效的途径。
2 实验部分
2.1 仪器与材料
TU1800分光光度计（北京普析通用有限责任公司）；LDZ52离心机（北京医用离心机厂）；蛋白纯化系统AKTA Purifier(Amersham Bioscienes)。
L酪氨酸（amersham pharmacia）为色谱纯，Sephadex G75为Amersham Pharmacia产品,三羟甲基氨基甲烷（Tris）和酪蛋白为Sigma产品，各种聚乙二醇（PEG 800、PEG 1000、PEG 2000、PEG 4000、PEG 6000）及其它试剂均为分析纯。1%酪蛋白溶液：称取1 g酪蛋白，先用1 mol/L NaOH润湿。加入pH 7.0的磷酸盐缓冲液，55 ℃加热，直至全部溶解。冷却后用pH 7.0的磷酸盐缓冲液定容至100 mL。0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)：取65.36 g TCA加入适量蒸馏水溶解，再用蒸馏水定容至1000 mL。0.2 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。实验用样品为自制风干香肠（不添加发酵剂）。
2.2 实验方法
2.2.1样品处理
把样品去皮，剪成厚度0.5 cm小块。液氮冻干后研碎。将其1∶9悬浮于4 ℃蒸馏水中搅拌15 min。然后4000 g离心15 min，取上清液作为粗酶液。
2.2.2 双水相体系制备
在50 mL离心管中加入适当的PEG、盐和蒸馏水,使体系质量达到20 g，用漩涡混合器混合3 min，形成ATPS。所得体系PEG富集于上相，下相为盐相 [１３] 。所选PEG分别为：PEG 800、PEG 1000、PEG 2000、PEG 4000和PEG 6000，各种盐分别为：NaH2PO4、KH2PO4、MgSO4、K3PO4和 (NH4)2SO4。最终体系PEG浓度达到质量比分别为15%、20%、25% 和30%，同时盐的质量比分别为15%、20%、25% 和30%。向双水相体系中加入5 mL粗酶液，混匀后2000 g离心5 min，使两相分层，记录各相体积，分别取上、下相测酶活和蛋白含量。
2.2.3 酶活力及蛋白质测定
取1 mL 粗酶液于37 ℃预热10 min，加入37 ℃预热的1%酪蛋白（以pH 7.0 PBS 配制） 2 mL，反应30 min，再加入3 mL 0.4 mol/ L TCA终止反应（对照先加TCA，后加底物） ，静置30 min，4000 g离心15 min，测上清液OD275值。在37 ℃ pH 7.0条件下，以1 mg蛋白酶水解酪蛋白30 min，OD275值变化0.01个光吸收单位为1个酶活力单位（Ｕ），为比酶活（SA)[1４] 。
采用Bradford法测定蛋白质，以牛血清白蛋白为标准。
2.2.4 分离纯化液分子筛层析检测条件
Sephadex G75（60 cm×1.6 cm），用20 mmol/L TrisHCl(pH 7.5)平衡，经透吸、浓缩后的酶液上柱，用20 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）洗脱（0.8 mL/min），用蛋白纯化系统AKTA Purifier(amersham bioscienes)检测并收集，每管收集5 mL，分别测定各峰区域酶活力。
采用SPSS11.0软件分析实验数据；所有的实验重复3次，每次取3个平行样。
3 结果与讨论
3.1 双水相体系中不同盐对蛋白酶萃取的影响
在双水相萃取时，核酸与多糖多分配于盐相，并且高盐浓度易造成酶失活，因此目标蛋白酶KE高的体系更有利于蛋白酶的分离[1５]。将20% PEG1000与不同浓度的NaH2PO4、KH2PO4、MgSO4、K3PO4和(NH4)2SO4组成双水相体系。不同盐组成的双水相体系对蛋白酶的萃取效果见表1。
由表1可知，20% PEG1000/25% MgSO4组成体系得到最高的比酶活（SA， 8.15 U/μg）与纯化倍数(PF，5.62），并且这两项显著高于其它配比（p＜0.05）。此体系中回收率处于中等偏上水平，有利于下一步回收。KP值较低，说明除蛋白酶外上相所含杂蛋白较少，因此选用25% MgSO4进行以下实验。
PEG/无机盐是最常用的双水相体系，其中无机盐常选用磷酸盐和硫酸盐类。本实验中PEG/(NH4)2SO4体系分离效果较好，但对比可知PEG/MgSO4体系的SA与PF都明显高于PEG/(NH4)2SO4体系，这与文献 [6]分离金枪鱼脾蛋白酶相同。
3.2 双水相不同分子量PEG对蛋白酶萃取的影响
运用25% MgSO4与不同浓度、不同分子量PEG对风干香肠粗酶液进行蛋白酶提纯，结果见见表2。由表2可见，分子量的变化对于目标蛋白酶的纯化影响较大。KＥ几乎都＞1，说明蛋白酶在上相的含量均较高。但是，随着分子量的增加KP也随之增加，导致上相杂蛋白含量增多，对进一步分离和应用都有较大影响，其中20% PEG1000/25% MgSO4组成体系得到最高的SA（12.37 Ｕ/μg）与PF（4.61），并且这两项显著高于其它配比（p＜0.05）。
同时获得较高KＥ值与较低KＰ值，回收率达到0.85，显著高于其它配比（p＜0.05）。因此选用20% PEG 1000/25% MgSO4组成体系进行下一步实验。
3.3 双水相pH值对蛋白酶萃取的影响
由于pH影响蛋白质的解离度，调节pH改变蛋白质的表面电荷数，从而改变分配系数[1６]。本研究中，在未调节pH值情况下体系pH值为3.45，用NaOH溶液调节pH值分别到4、6、7、9，分离萃取结果见表3。表1 不同盐组成的双水相体系对蛋白酶的萃取效果（略）注(note)： 字母a、b、c、……, m在同一列中相同表示差异不显著，不同则表示差异显著（p＜0.05）(a, b, c,……, m means within a row not sharing a common superscript differ significantly (p＜0.05))。“－”没有形成双水相(no ATPS formed)。ＶＲ为体积比（volume ratio）, KＰ蛋白分配系数(protein distribution coefficient)； KE：酶活分配系数（enzyme distribution coefficient）； SA：为比酶活(specific activity)； PF： 纯化倍数(purified fold).表2 不同PEG组成的双水相体系对蛋白酶萃取效果（略）注(note)： 字母a, b, c, ……, p在同一列中相同表示差异不显著，不同则表示差异显著是（p＜0.05）(a, b, c,……, p means within a row not sharing a common superscript differ significantly (p＜0.05))。“－”没有形成双水相 (no ATPS formed)。由表3可见，当pH＞3.45时SA、PF与回收率呈显著下降趋势（p＜0.05）， pH 3.45时KP仅为0.18，与pH＞3.45相比上相蛋白含量减少。而pH＜3.45时，蛋白沉淀无法形成双水相体系。因此，上调或下调20% PEG1000/25% MgSO4组成的双水相体系pH值(3.45)对萃取风干香肠的蛋白酶并无益处。表3 体系不同pH值对蛋白酶萃取效果（略）注 (note)： 字母a、b、c和d在同一列中相同表示差异不显著，不同则表示差异显著（p＜0.05）(a, b, c and d means within a row not sharing a common superscript differ significantly (p<0.05))。“－”没有形成双水相 (no ATPS formed)。
3.4 NaCl对双水相蛋白酶纯化的影响
在双水相体系中加入电解质，由阴、阳离子在两相中的分配差异，形成穿过相界面的电位，从而影响带电大分子物质在两相中的分配，强化分配效率[1７]，通常选择NaCl作电解质。Monica利用聚乙二醇(PEG)/磷酸盐双水相体系提取天然发酵物中的碱性木聚糖酶，确定最佳体系是22% PEG 6000、10% K2HPO4和12%NaCl，目标酶的产率可达98%。
本实验加入不同浓度NaCl，通过其分相参数研究电解质对蛋白酶纯化的影响，结果见表4。由表4可见，添加NaCl对蛋白酶的分离无强化作用，相反不添加NaCl的体系各项指标都较好。故确定不添加NaCl的双水相体系。焦庆才[１8]用PEG/(NH4)2SO4体系分离发酵液中α淀粉酶和蛋白酶时也得到同样结果。表4 NaCl浓度对蛋白酶萃取效果（略）注(note)： 字母a、b、c和d在同一列中相同表示差异不显著，不同则表示差异显著（p＜0.05）(a, b, c and d means within a row not sharing a common superscript differ significantly （p<0.05）)。
3.5 双水相纯化蛋白效果
洗脱液(disengage liquid)：20 mmol/L TrisHCl(pH 7.5)；流速(flow velocity) 0.8 mL/min。对风干香肠制成的粗酶液与经过双水相得到的酶液用分子筛层析Sephadex G75（60 cm×1.6 cm）[15]进行分离处理，经蛋白纯化系统AKTA Purifier检测，结果见图1。图1a为风干香肠粗酶液通过分子筛的图象，对所得的两个峰分别测定其酶活,结果在50～100 min时段所得的峰没有蛋白酶活；100～200 min时段所得的峰蛋白酶活OD275为0.335。图1b中所得峰的蛋白酶活OD275为0.258，与图1a相比酶活损失不大。表明经过双水相处理的肉样杂蛋白峰被除去而蛋白酶峰几乎未受到影响，说明双水相萃取香肠中蛋白酶专一性较好，适合于风干香肠中蛋白酶的萃取。
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