冷冻式巴氏涂片技术的研究与应用
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首席医学网
2008年10月08日 16:09:23 Wednesday
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作者：毛荣军，王桂芳，李启明 作者单位：1. 广州中医药大学附属佛山中医院,广东 佛山 528000;2. 佛山市顺德区桂洲医院, 广东 佛山 528305
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【摘要】 目的:探讨提高巴氏涂片质量的改良方法。方法:尝试应用冷冻式巴氏涂片技术对宫颈病变进行检测，观察改良后巴氏涂片的形态效果。结果:涂片的细胞量充足，重叠减少、形态结构清晰，无皱缩自溶现象，着色良好，色彩艳丽，浆核对比突出，胞质、核染色质、核仁和其他细胞成分易于识别，细胞境界清楚，透明度良好。结论:冷冻式巴氏涂片技术是建立在传统巴氏涂片基础上的一种改良技术，该法在制片的过程中强调注重取材制片的全过程，其核心步骤是把固定好后的细胞玻片置入细胞形态修复液中，利用渗透膨胀的原理对已干枯萎的细胞进行修复，从而达到恢复细胞形态的目的，促进细胞着色，提高细胞透明度和清晰度，有利于对病变细胞的识别和提高对宫颈病变细胞的阳性检出率、特异度和灵敏度，降低漏诊误诊率。该技术无需特殊设备及耗材，成本低廉，操作简单，实用性强，具有较好的应用推广价值。我们还认为，传统巴氏涂片的缺点不是固有不变的，而是取决于临床及细胞病理医生之间的互动，他们是否真正具备耐心和以谨慎的态度来重视巴氏涂片的各个细节是提高巴氏涂片质量的关键。
【关键词】 宫颈癌筛查 巴氏涂片 技术改良
Application and Research on the Freezing Technology of Papanicolaou Test
MAO Rong-jun1,WANG Gui-fang2,LI Qi-ming1
（1.Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine;Guangzhou University of Chinese Medicine,Foshan 528000,China；
2. Guizhou Hospital of Shunde ,Foshan, Guangdong 528305, China）
Abstract: Objective To investigate on the method of improving papanicolaou test quality. Methods Attempt to use freezing technology of papanicolaou test for detecting cervical lesion and observing cervical cells morphology changes under light microscopes. Results An adequately cellular cervical cytology smear,the reduce of cells overlay, the integrality of cells morphology, the clear structure of cells and unconspicuous phenomenon of dissolving and cell shrinkage were observed , the cells were stained well and flamboyantly, the contrast ration was outstanding between cytoplasm and nucleu, the cytoplasm, nucleus,karyosome,and other components were easy to be resolved, the cells boundary,transparence showed clearly.Conclusion The freezing technology of papanicolaou test is one meliorative technique based on papanicolaou test, the technique emphasizes on every process of sampling,smearing and staining, the most important step is the fixed smears should be soaked into the restoring-liquid of cells morphology based on the theory of penetration and expansion principle,thus achieve the purpose to cells restoring their normal appearance,to promoting cells staining and to improving cells transparency and clarity, it will be favorable to improve the cells recognition rate,the positive rate,the specification,sensitivity and decrease leaking rate and misdiagnosis rate.The meliorative technique is simple and low cost, it needn't special equipments and consumables,it has rather good practicability and reliability that would have a great future in spread and application. We also think that the shortcomings of traditional papanicolaou test are not constant but depend on the interaction between clinician and cytopathologist ,their patience and attitude are the key for High Quality of papanicolaou test.
Key words: Cervical carcinoma screening; Papanicolaou test; Technical improvement
传统巴氏涂片技术的应用已有达50余年，为世界范围内宫颈癌的防治作出了极其重要的贡献[1]。它采用的方法是应用棉签及刮板等采样器在宫颈处采集细胞样本，直接涂抹于玻片上并固定30 min后直接进行染色，其特点：简便快捷，成本低廉，但该技术被认为具有一个天生的缺陷，即细胞收集不全，涂片细胞重叠，着色不良。由于存在上述缺陷，医学专家相继发明了多种细胞学改良技术如TCT、LCT等技术，对于避免传统巴氏涂片的缺陷具有一定的作用，但这些技术操作复杂，需要具备特殊设备及专用耗材，成本高昂，难于普遍推广，实际应用中具有很大的局限，特别是在需要进行大批量细胞涂片检测时，上述技术缺陷表现得更为突出[2～4]。
为了克服传统巴氏涂片技术的缺陷及其他新技术成本高昂的弊端，本文报告一种依据传统巴氏涂片的技术原理进行改良的技术方法，命名为“冷冻式巴氏涂片检测方法”，现报告下。
1 材料与方法
1.1 标本
研究样本来自本院及佛山市顺德桂洲医院体检中心于2005年5月至2007年12月期间送检的标本5 500例，分别采用传统巴氏涂片及冷冻式巴氏涂片的制片方法进行涂片制作。
1.2 方法
1.2.1 操作步骤
标本采集时应用宫颈细胞专用采样器（国家实用新型专利号：ZL200420043365.4）在宫颈移行区进行规范性采样；取样完成后迅速将采样器上的细胞均匀涂抹在清洁的玻片上的一端2/3面积上；带有细胞的玻片迅速置于细胞固定液中固定30 min；固定后细胞玻片送到细胞病理室即刻或稍缓后置于细胞形态修复液中1 min～5 min；经形态修复液处理后的玻片放入冰箱冷冻层内30 min以上或更长时间（不限时长）；冷冻后取出玻片在常温下直接进行HE染色染色、镜下观察并按TBS诊断标准进行诊断。
1.2.2 HE染色方法
冷冻后细胞玻片水洗1 min；苏木精液染色3 min；流水洗去苏木精液1 s～3 s；1%盐酸乙醇分化1 s～3 s；水洗10 s～30 s；促蓝液返蓝10 s～30 s；流水冲洗10 min～15 min；水洗1 s～2 s；95%乙醇1 min～2 min；沉淀酸化伊红Y乙醇工作液染色1 s～5 s；水洗1 s～2 s；80%乙醇洗1 s～2 s；95%乙醇3 s～5 s；无水乙醇5 min～10 min；石炭酸二甲苯5 min；二甲苯（I）2 min；二甲苯（II）2 min；二甲苯（III）2 min；中性树胶封固，凉干后送细胞诊断室。
1.2.3 主要染色液的配制
苏木精染液配制:配好苏木精染液是HE染色的关键，苏木精配制有多种配方，关键在于氧化，如加氧化汞作氧化剂时，要防止氧化过度，同时注意形成的氧化膜污染切片。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木精液煮沸。要配制自然成熟的苏木精则不需加氧化剂，但要较长时间才能氧化成熟。不同苏木精染液的染色时间为3 min～20 min，自然氧化成熟的苏木精液染色时间可以更长。我们使用Harri's苏木精配制方法即取苏木精1g，无水乙醇10 ml，硫酸铝钾20 g，蒸馏水200 ml，氧化汞0.5 g，冰醋酸8 ml，分别用无水乙醇溶解苏木精，蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后两液混合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌至溶液为深紫色，立即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。
沉淀酸化伊红Y乙醇工作液配制:对于巴氏涂片的伊红染色至关重要，选取配制不同的伊红工作液将影响细胞浆的染色。实践中我们认为采用沉淀酸化法配制的伊红Y乙醇工作液，其染色效果极佳，具体如下：取伊红20 g，蒸馏水500 ml,将伊红与蒸馏水充分溶解后加浓盐酸10 ml，用玻璃棒不断搅拌，放置过夜析出沉淀。用一张大号滤纸过滤。滤液不要，加蒸馏水洗涤留在滤纸上的沉淀。蒸馏水过滤后，再加蒸馏水洗，如此反复多次洗涤后，将沉淀物连同滤纸一起放置在恒温箱中干燥，用95%乙醇1 000 ml配成饱和液，此即沉淀酸化伊红Y乙醇饱和储存液。使用时取饱和液1份，加95%乙醇1份。玻片在进入该伊红液前，须先入95%乙醇1 min～2 min。
2 结果
镜下所见：细胞形态结构清晰，无皱缩自溶现象，细胞着色良好，颜色清晰艳丽，与蓝色的细胞核对比突出，胞浆、核染色质、核仁和其他细胞各成分清晰，细胞境界清楚，细胞分辨度、透明度、对比度良好。与传统巴氏涂片比较，该方法显著地改善了传统巴氏涂片细胞染色欠佳，着色不良，细胞境界难于辨识的弊病。通过上述处理后的涂片即使细胞区域涂具有一定的重叠及炎症细胞过量时，细胞的轮角仍然清晰可现。对于有病变的细胞及相关成分（癌细胞、癌前病变、真菌、挖空细胞等）易于识别，明显提高了诊断率，降低漏诊率。通过前述的规范性细胞取样及涂片，镜下细胞量充足，重叠明显减少，挤压变形的无效细胞量较少。
3 讨论
以George Papanicolaou博士命名的巴氏细胞涂片方法进行宫颈癌的筛查已有近50 a，对宫颈癌及癌前病变的发现及治疗产生了深刻的影响。由于该项技术操作简便，无需特殊设备，从而得以在许多国家推广并成功地降低了子宫颈癌的发病率和死亡率，但在长期的应用过程中发现，巴氏涂片存在数量不小的漏诊误诊率，因此，有人认为传统的巴氏细胞涂片本身是一项筛查子宫颈癌重要而不完美的筛查方法,相关文献报告中发现传统巴氏涂片对宫颈的高度病变和癌有较高的特异度，但灵敏度偏低。高特异度意味着细胞学能够正确识别那些确实患有高度病变或子宫颈癌的妇女，特异度较低意味着细胞学仅能识别相对少部分患高度病变或癌的妇女，在保持高特异度的情况下很难增加灵敏度。据最近的一些分析报道，巴氏细胞学涂片的灵敏度相当低，在50％左右，有些甚至仅为20％[5,6]。在津巴布韦的一项研究中，巴氏细胞学涂片识别高度病变的灵敏度为44％，特异度为91％[7]，这些研究者指出当卫生决策者制定卫生政策时，应将巴氏涂片检查低灵敏度予以考虑。
分析传统巴氏涂片存在的缺陷，主要表现在细胞收集不全，有达80%以上的细胞随取样器被丢失[8];涂片细胞严重重叠、分布不均，堆积过多血液、黏液及炎细胞，炎细胞使异常细胞被遮盖，有研究提出有多达40%的涂片因质量问题而影响诊断[9]，细胞收缩明显、着色不良，核浆染色欠佳，各成分辨识不清，尤其在涂片较厚，细胞重叠显著的区域细胞分辨率更差，严重影响观察，从而造成漏诊误诊；另外当玻片上的细胞未能及时固定及染色处理时则易于导致细胞变形，后续的着色效果及形态观察将受到严重的影响。分析着色不良的原因可能为经高浓度乙醇或乙醇乙醚混合固定液固定后细胞固缩，黏液变性固化，染色过程中染色剂不易穿透黏液变性膜，致使黏液包裹的细胞着色不良，核浆染色欠佳，尤其是涂片较厚，黏液较厚、细胞重叠显著的区域细胞分辨更差，严重影响观察，易造成漏诊误诊；另外当固定的细胞未能及时染色处理则细胞容易皱缩变形，后续染色效果及形态观察将受到严重影响。很显然，传统巴氏涂片存在的上述缺陷确实会给宫颈癌的筛查带来一定的负面影响，问题的根源是临床妇科医生及细胞病理学医生缺乏严格的培训，从而造成对巴氏涂片方法的重视不足，使得他们没有从根本的技术环节上去掌握和应用巴氏涂片方法。一直以来，普遍认为巴氏涂片方法简单，是一种“没有技术的技术”，加上一些新的细胞学技术的问世和过度宣传，巴氏涂片几乎成为误诊漏诊的“罪魁祸首”，造就了人们对巴氏涂片方法的“过时”印象，导致对该项技术的漠视，最终形成对该技术的具体环节的细致性的忽略。其实，新的宫颈细胞学技术都是建立于巴氏涂片技术的基础上，本质上是对巴氏涂片技术的改良。值得借鉴的是这些新技术着重强调了每一个环节，如细胞的收集、保存、薄层细胞制片、细胞量的要求及不合格标本的重取以及专门的染色液配制等，进而制定统一规范的宫颈细胞学TBS诊断标准系统，对宫颈细胞病变筛查结果的提高起到了关键作用[10]。如果在传统的巴氏涂片技术中我们亦遵循上述原则来规范巴氏涂片的各个环节，真正把握好细胞取样、涂片及染色等的各个过程，那么，同其他新的细胞学技术一样，巴氏涂片技术将有质的飞跃。
关于巴氏涂片的取材方面，传统的取材器是刮板、棉签等。刮板质硬，与宫颈口的解剖形状很不相称，难于在宫颈移行区及周围全面取材且易于引起局部损伤、出血，摄取的细胞量常常不足，故代表性有限，而粘在刮板上的细胞不易转移到玻片上；棉签取材时相对灵活，可在宫颈移行区及周围旋转从而能够全面取材，但不足的是，棉签涂片时由于细胞与棉絮的粘附性极强，只有少量的细胞能转移到玻片上。一些新的细胞学技术问世后，扫帚形宫颈细胞取样器曾被应用于传统巴氏涂片的取材，但由于此种取样器的设计是基于液基薄层细胞学制片技术的需要，取出的细胞直接涂抹玻片上时很难使细胞均匀分布，容易导致细胞挤压变形，从而影响观察。鉴于上述弊端，我们认为，一种较理想的巴氏涂片取样器应该具有质软而与宫颈移行区周围的解剖学特点相适应的特点，能进退旋转而不损伤宫颈组织，能充分粘附细胞并能大部分或全部转移到玻片上。为此，在本研究中我们试图设计了一种专用的巴氏涂片取样器，在应用中发现它能够满足上述取材的要求，即获得充足的移行带细胞、宫颈管细胞及外口鳞状细胞，涂片中的细胞结构清晰,无挤压，细胞平铺，背景较干净，便于观察，从取材的第一环节上保证了获得理想的细胞量。需要强调的是，要做好取材前的准备工作，包括指导患者的配合，宫颈过多血液、黏液的清除等。
关于涂片的方法，在洁净的非标签端玻片上（占据整张玻片2/3面积）用带有细胞的取样器迅速并轻柔地贴附在玻片上（感觉取样器刚刚接触玻片），反复进退及旋转取样器并在玻片上移动，以分层的方式均匀地把细胞涂布在玻片中，可以重复涂布，这样可以使取样器上充的足细胞尽量转移并填充到玻片空白的区域。在进行此项操作时动作要迅速，避免细胞干燥变形，切忌用力把取样器压在玻片上移动涂片，否则细胞变形，从而严重影响形态观察，涂好后的玻片迅速放到细胞固定液中固定30 min以上。固定好后的细胞玻片可以直接送到细胞病理室立即进行HE染色或巴氏染色，我们习惯于用HE染色。实际上在实际工作中往往很难做到把固定后的细胞立刻作后续的染色处理，因为样本取材的地点距离细胞病理室具有一定的距离，尤其在较大的医院或体检中心进行大批量体检时，常因人手紧缺或器具配备不足，不得不把已固定的细胞玻片取出并放置于干燥炎热的环境中数小时甚至数个月才进行后续的染色，结果细胞形态明显变形，结构不清，细胞周围的黏液高度交联变性形成的封闭性保护膜，使染色剂难于穿透，从而导致细胞着色不良，严重影响观察。为了修复这种形态学改变，我们需要解决这样的技术环节：舒缓黏液膜的交联变性，增强穿透性，促使黏液内包裹的细胞形态学修复和增强细胞染色的渗透性。
研究中我们发现，固定后的细胞玻片无论立即或在自然环境中放置一定时间后置入一种细胞形态修复液中处理十余分钟后再取出放入冰箱冷冻层，直到便于染色时取出放入HE染色液中染色。实验证实，经过上述处理后的细胞学形态具有较为理想的效果，我们把这种方法称之为“冷冻式巴氏涂片改良技术”。其技术原理为：经过高浓度乙醇或乙醇乙醚固定后的黏液及细胞，在这些固定液的作用下黏液内的蛋白分子发生构变，形成一层较为致密的膜状物粘附并包裹于细胞的周围，细胞固定后细胞内的各种成分亦发生形态同步性浓缩改变，起到相对保持细胞形态的作用，但细胞及细胞内成分收缩明显，变形的粘液分子发生绞连，致密地封闭在细胞的周围，显著影响染色剂渗透入细胞内而使细胞染色不良。本方法将固定后的细胞玻片或干燥变性的细胞玻片置入形态修复液中处理后，由于形态修复液本身具有较强的渗透作用而迅速进入黏液及细胞内，在冰箱冷冻层内速冻，应用水性液体在冰体状态下体积膨胀扩张的原理，渗透入黏液及细胞内的液体在冷冻状态下形成冰晶，并使细胞膨胀直至细胞膜达到张力自限时恢复细胞生活时的形态及体积，黏液内浸入形态修复液后在冷冻状态下冰晶膨胀于变性绞连的糖蛋白粘液分子之间，致使绞连分子解开绞合，各种细胞及细胞成分以及粘液分子布散于恢复液形成的冰晶之间，粘液变得松散稀薄，黏液细胞黏附松解，从而使细胞各成分的渗透性明显增强。经过上述处理后，附有细胞的玻片直接进入配制的染色剂内进行HE染色（在伊红染色时使用沉淀酸化伊红Y乙醇工作液），结果发现细胞染色快，分化时不褪色，镜下观察显示，细胞着色显著改善，颜色清晰艳丽，与蓝色的细胞核对比突出，核浆及细胞各成分清晰，细胞与细胞之间境界清楚，分辨较佳，核浆着色分明，尤其时深藏在黏液中的细胞群能较好染色，显著地改善了传统巴氏涂片细胞染色不佳的状态，即使涂片具有一定的重叠，但细胞的轮角仍然清晰可辨，需要提及的是，通过前述的细胞规范性取样及涂片，镜下细胞量充足，重叠明显减少，挤压变形的无效细胞量少。
我们认为“冷冻式巴氏涂片改良技术”能有效地修复细胞学的形态，特别适用于大批量妇检时细胞玻片未能及时处理而长时间留置干燥环境中后细胞的修复，对恢复变性细胞形态及保持良好的染色效果起到重要作用。使用该技术无需特殊设备及耗材，成本低廉，操作简单，实用性强，具有较好的应用价值。从我们的研究中可以得出结论，传统巴氏涂片的缺点不是固有不变的，而是取决于临床及细胞病理医生是否真正具备耐心和谨慎的态度来重视这一技术的各个环节。我们深信，在不久的未来，传统的巴氏涂片方法会得到进一步的认识和肯定。
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