促红细胞生成素受体抗体抑制小鼠视网膜新生血管形成
【摘要】
目的：观察促红细胞生成素受体抗体(erythropoietin receptor antibody，EpoRA)对视网膜新生血管形成的抑制作用。
方法：将鼠龄为7d的C57BL/6J幼鼠置于750±20mL/L氧仓中连续饲养5d，建立高氧诱导的血管增生性视网膜病变模型。幼鼠20只右眼在建模前1d予以玻璃体内注射EpoRA 2μL作为治疗眼，左眼不注射作为对照眼。在H.E.染色的组织学切片上观察并计数突破视网膜内界膜进入玻璃体的新生血管内皮细胞核数目;用ADP酶组织化学法行视网膜铺片，观察视网膜血管改变。饲养在正常条件下的幼鼠作为正常对照组；模型幼鼠8只仅在玻璃体内注射生理盐水，作为阴性对照组。结果：在组织切片上，可见突破视网膜内界膜进入玻璃体腔内的新生血管内皮细胞核，在用EpoRA注射的右眼，明显少于未经EpoRA注射的左眼（17.20±5.42个 vs 23.47±8.43个；P<0.01）。ADP酶组织化学法视网膜铺片中，可见视网膜新生血管的密度和异常程度，在用EpoRA注射的右眼，明显轻于未经EpoRA注射的左眼以及阴性对照组。正常对照组未见明显异常。结论： EpoRA可抑制小鼠模型中的视网膜新生血管形成。
【关键词】 促红细胞生成素受体抗体；视网膜新生血管；小鼠
Inhibitory effects of erythropoietin receptor antibody on retinal neovascularization in mice
PengFei Liu, YanNian Hui, XiaoPing Xie
1Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China; 2Department of Aeroastromedicine, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China
Correspondence to :YanNian Hui. Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China. fmmuhyn@fmmu.edu.cn
AbstractAIM: To investigate the effects of erythropoietin receptor antibody (EpoRA) on retinal neovascularization in mice.
METHODS：Sevendayold neonatal C57BL/6J mice were exposed to (750±20)mL/L oxygen to establish models of vascularproliferative retinopathy. The right eyes of the mice received a vitreous injection of 2μL EpoRA one day before the mice exposed to high oxygen condition. The left eyes without EpoRA injection served as controls. The effects of EpoRA on retinal neovascularization were evaluated by counting the endothelial nuclei of new vessels extending from the retina to the vitreous in histological sections with HE staining. The ADPase histochemical staining was used for retinal flatmount to observe the changes of retinal vessels. Neonatal mice fed in normal conditions served as normal controls; and 8 model mice only received an intravitreal injection of physiological saline served as negative control group. RESULTS：The number of the endothelial nuclei of new vessels extending from the retina to the vitreous was significantly less in the right eyes with EpoRA injection than that in the left eyes without EpoRA injection in the model (17.20±5.42 vs 23.47±8.43, P<0.01). In the retinal flatmounts, the density and abnormality of retinal new vessels were noted much less in the right eyes with EpoRA injection compared to that of the left eyes without EpoRA injection in the model group and negative control group. No obvious changes were found in normal control group.CONCLUSION：Retinal neovascularization can be inhibited, to some extent, by intravitreal injection of EpoRA in this mouse model.
KEYWORDS:erythropoietin receptor antibody; retinal neovascularization; mouse
0引言
视网膜新生血管性疾病是致盲的主要原因之一，糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞及早产儿视网膜病变等多种疾病均能引起视网膜新生血管的产生，导致血管增殖性病变。因此，抑制视网膜新生血管对治疗这类疾病有重要意义。既往认为，缺血缺氧的视网膜可产生多种生长因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）剌激新生血管生成，近年在临床上应用抗VEGF疗法取得一定效果，但抑制VEGF通路后并不能完全抑制视网膜新生血管的产生。近来发现促红细胞生成素（erythropoietin，Epo)是一个独立的促视网膜新生血管形成的因子[1]。我们设想，如果使用Epo拮抗剂，应能抑制视网膜新生血管的形成，因此，采用小鼠模型进行了本实验。
1材料和方法
1.1材料
鼠龄为7d的健康C57BL/6J小鼠36只，性别不限，与母鼠共同饲养，系清洁级动物，由第四军医大学实验动物中心提供。EpoRA为R＆D Systems、Inc. America产品，ADP购于北京舟鼎国生物有限责任公司，高压氧仓为DWC4501150型动物实验仓（上海七零一所杨园医用氧仓厂），由第四军医大学航空航天医学系提供。
1.2方法
小鼠36只，其中28只置于氧仓中建立视网膜新生血管模型[2,3]，其中20只右眼玻璃体腔内注射EpoRA作为治疗组，左眼不注射药物作为对照眼；8只双眼注射生理盐水作为阴性对照组；正常对照组8只在常氧环境下饲养。小鼠出生后7d同母鼠共同置于密闭氧仓中，氧仓连接氧浓度测量仪，保持氧箱内氧浓度为750±20mL/L，每日打开氧仓2次各1h，防止母鼠在高氧环境中死亡，小鼠在氧仓内未见烦燥不安等行为异常，全部小鼠无1例死亡。5d后将小鼠取出置于常氧环境中饲养，至出生后17～21d将小鼠处死。幼鼠均于生后6d于麻醉后进行玻璃体腔注射。注射器采用自制的、连于细玻璃管拉丝的微量加样器。注射前先用30G针头于角巩膜缘后做一小穿剌口，微量加样器伸入玻璃体内注射生理盐水或EpoRA 2μL（经预实验筛选的最佳药物浓度为1∶10[4]）。小鼠眼球常规于眼球固定液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，做一系列连续矢状切片，厚度5μm，任意选取不包括视乳头的20张切片，在低倍镜下统计平均每张眼球切片突破视网膜内界膜而长入玻璃体内的血管内皮细胞核数。小鼠处死后摘出眼球，置于40g/L甲醛中12h，在解剖显微镜下除去角膜、晶状体、脉络膜及巩膜。将游离视网膜以视乳头为中心放射状对称剪为4瓣，30g/L胰蛋白酶37℃消化7h，行ADP酶组织化学法染色，光学显微镜观察结果，数码照相机照像。
统计学处理：各组间比较采用SPSS 11统计软件行t检验，进行统计学处理。
2结果
2.1视网膜血管内皮细胞核
正常对照组鼠龄为l7d的20张组织切片中，内界膜清晰、连续，未发现或仅在少数切片中见到视网膜内界膜附近玻璃体内的血管内皮细胞核，平均每张切片中为0.12±0.35个(图1A)。模型组左眼（未注射EpoRA）的组织切片中，内界膜不连续，玻璃体腔内可见大量由单个或多个血管内皮细胞组成的新生血管，平均每张切片中新生血管内皮细胞核数为23.47±8.43个(图1B)，与正常对照组相比，差异有非常显著的统计学意义(t=15.227，P<0.01)，表明该视网膜新生血管动物模型建立成功。在鼠龄17d、注射EpoRA眼的20张组织切片中，突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目为17.20±5.42个(图1C)，较未注射EpoRA眼明显减少，两者相比，有非常显著的统计学差异(t=3.425，P<0.01)。阴性对照组与模型组结果类似。
2.2视网膜新生血管
正常对照组，视网膜血管自视盘发出，向周边呈放射状均匀分布，血管走行直，分支良好，周边部视网膜血管网结构清晰，视网膜血管可见分深浅两层。并通过血管网互相连接(图2A)；模型组可见大量的视网膜新生血管，血管分布紊乱、走行迂曲，血管密度较正常对照组明显增多(图2B)；注射EpoRA的治疗眼血管密度较未注射EpoRA眼明显减少，血管迂曲程度也明显减轻(图2C)。
3讨论
视网膜新生血管常见于糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变等疾病，是致盲的主要原因之一。由于严重危害视力，一直是眼科临床关注的热点。研究表明，缺血缺氧是视网膜新生血管的始动因素，缺血缺氧的视网膜可产生多种生长因子（如VEGF）剌激新生血管生成，造成视网膜增殖性改变。多变量分析显示，Epo和VEGF与血管增生性视网膜病变独立相关，糖尿病性视网膜病变患者玻璃体液中，Epo水平比非糖尿病患者明显升高。在糖尿病视网膜病变中，Epo比VEGF相关性大[5]，因此，治疗视网膜血管增殖性疾病联合用药应效果更佳。针对VEGF，现人们已经应用VEGF的mAb Avastin行玻璃体腔注射，以控制糖尿病性视网膜病变。我们试图证实，EpoRA对视网膜新生血管形成具有抑制作用，及其应用于临床作为血管增生性视网膜病变药物治疗的可行性。
我们选用的视网膜新生血管模型制作容易，成功率高，便于观察，可重复性好，并且有可定量的优点，与疾病的发生发展及病理生理有很大的相似性，小鼠出生后7d视网膜发育尚不完全，移至高氧环境中血管发生痉挛、闭塞，形成无灌注区，移至常氧条件后无灌注区发生缺血缺氧，产生新生血管，17～21d后视网膜新生血管达到高峰[6]，因此是一种成熟可靠的动物模型。玻璃体注药全身副作用少，局部药物浓度大，我们通过自制的连接于玻璃拉丝的微量加样器自小鼠角巩膜缘后穿剌，玻璃体腔内注射EpoRA 2μL，观察其对视网膜新生血管的影响。结果表明，EpoRA能明显抑制视网膜新生管的形成。但是，本实验中，玻璃体注药后视网膜组织切片仍见突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目为17.20±5.42个，仍明显高于正常对照组，考虑原因是多方面的，与药物性质、剂量、注射时间、是否需要重复注射等多种因素有关，需要对EpoRA的玻璃体药代动力学等作进一步研究。在操作上也有一些问题，如：6d龄小鼠眼球玻璃体腔容积较小，估算约为2～4μL，且不能放房水以降低眼内压，虽然我们尽量提高EpoRA浓度来减小注射量，但仍需注射2μL，相对于小鼠玻璃体容积偏大，每次注射后总有一定的药液流出；另外，虽然我们尽量减小穿剌口，但相对于小鼠眼球仍为较大创伤，不可避免会发生不同程度的葡萄膜炎反应，葡萄膜炎可促使Epo生成增加，降低治疗效果。
以往认为，Epo主要是调节红细胞生成的造血细胞因子，Epo和它的受体主要存在于骨髓的造血干细胞并刺激它向红细胞分化。Epo产生于胎儿的肝脏和成人的肾脏[7,8]，最近也相继报道，许多肝肾外组织如脑、胚胎、神经系统、卵黄囊、子宫及视网膜等产生Epo。在这些组织中，越来越多的证据表明Epo有促进新生血管生成的作用，如，贫血的婴幼儿予以Epo全身治疗后发生早产儿视网膜病变的机率明显增加；EpoR mRNA在内皮细胞中被发现；Epo在活体及体外都能促进内皮细胞的增生和移行[9]。有研究证实，血清与玻璃体内Epo浓度没有明显关系，考虑玻璃体内增高的Epo不是源于血视网膜屏障的破坏，而是视网膜局部的产物，免疫组织化学法显示在正常视网膜组织中的Epo主要是由Müller细胞产生的[10]。Epo的基因表达和VEGF一样受氧浓度调节，氧浓度降低时表达增强，从而增加微循环中红细胞数量，提高缺氧环境中组织的血氧含量，氧浓度对Epo调节的分子机制目前还不清楚，有研究表明酪氨酸激酶在新生血管产生过程中起重要作用[11,12]。
Epo抑制剂虽然对血管增生性疾病有益，目前研究较多的是用于糖尿病性视网膜病变的治疗，但Epo对视神经及光感受器还有保护作用，如盲目使用会加重糖尿病神经病变及光感受器的凋亡，Epo抑制剂能否作为糖尿病视网膜病变的治疗用药，还有待进一步研究。
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