体外培养人晶状体上皮细胞整合素的表达
-
首席医学网
2008年11月12日 14:30:13 Wednesday
-
作者：姚刚，谭少健 作者单位：（530021）中国广西壮族自治区南宁市，广西医科大学第一附属医院眼科中心；（530021）中国广西壮族自治区南宁市，广西壮族自治区人民医院眼科中心
加入收藏夹
【摘要】
目的：研究体外培养人晶状体上皮细胞整合素的表达。
方法：对人晶状体上皮细胞株SRA01/04进行培养并传代，经间接免疫荧光标记法处理细胞后上流式细胞仪检测各整合素的阳性表达率。
结果：整合素α2，α3，α5，β1，β2在SRA01/04的阳性表达率分别为85.3％，97.6％，74.0％，97.7％，3.65％。整合素α3与β1之间无统计学差异（P>0.05），其余两两间比较均有显著统计学差异（P<0.01）。
结论：人晶状体上皮细胞株SRA01/04整合素呈阳性表达。
【关键词】 整合素 人晶状体上皮细胞 表达
Expression of integrins in cultured human lens epithelial cells in vitro
Gang Yao, ShaoJian Tan
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No.30760268)
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Department of Ophthalmology, the Peoples Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Abstract
AIM: To study the expression of various integrin subunits in cultured human lens epithelial cells (HLECs).
METHODS: The HLECs, SRA01/04, was cultured. Flow cytometry (FCM) were used to detect the positive percentages of different integrin subunits in SRA01/04.
RESULTS: Our study showed that the HLECs line, SRA01/04 expressed α2, α3, α5, β1 and β2 integrin subunits. The positive percentages were 85.3%, 97.6%, 74.0%, 97.7%,and 3.65%,respectively.There were significant differences of positive expression percentages between each two integrin subunits (P<0.01), except for α3 and β1 (P>0.05).
CONCLUSION: The positive expressions of α2, α3, α5, β1 and β2 integrin subunits present in the HLECs line, SRA01/04.
KEYWORDS: integrin; human lens epithelial cells; expression
0引言
后发性白内障（posterior capsule opacification，PCO）又称后囊膜混浊，是白内障囊外摘除术后的主要并发症之一，其发生的主要机制为残留的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LECs）增生、迁徙、分化以及胶原和基底膜样物质形成[1]。整合素是一类介导细胞与细胞、细胞与间质之间相互作用的细胞表面受体，广泛表达于多种细胞[2]。近年来研究表明，LEC表面亦表达多种整合素，可能对LEC的粘附、移行及增殖起促进作用，从而导致PCO的发生[37]。研究整合素在LEC的表达及其与PCO的关系，具有重要的临床意义。我们应用流式细胞仪准确测定人晶状体上皮细胞株SRA01/04上整合素α2，α3，α5，β1和β2的表达。
1材料和方法
1.1材料 人晶状体上皮细胞株SRA01/04由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供。DMEM/F12培养基（Gibco公司）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，天津灏洋TBD公司）、小鼠抗人整合素α2，α3，α5，β1，β2一抗（美国Serotec公司）、FITC标记的小鼠IgG1,k 同型抗体（美国BioLegend公司）、FITC标记山羊抗小鼠二抗（美国KPL公司）、流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。
1.2方法 将人晶状体上皮细胞株SRA01/04移入25cm2培养瓶中，加入含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基5mL，置于37℃，50mL/L CO2培养箱中培养，每天在显微镜下观察细胞生长情况，2～3d换液1次，3～4d后可见细胞相互融合，长满瓶底。此时进行消化传代：吸出培养液，用磷酸缓冲液(phosphate balanced solution, PBS)充分冲洗，加入2.5g/L胰蛋白酶及0.2g/L乙二胺四乙酸二钠(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)混合消化液2mL，37℃温箱中消化约5～7min，置于显微镜下观察，待细胞皱缩后，加入完全培养基终止消化，反复轻轻吹打将细胞完全脱离瓶壁，移入离心管，800rpm离心5min，去除上清液，加入完全培养基重悬细胞，按1∶3传代，移入培养瓶，置于CO2恒温培养箱中培养。倒置相差显微镜观察：细胞属贴附型上皮样细胞，呈不规则多角形，镶嵌排列，细胞无色，折光性强。HE染色见胞质淡染呈红色，胞核呈蓝色，核仁多为1～2个。免疫组化观察α晶状体蛋白呈褐色阳性反应，对照组为阴性。 实验分对照管及实验管。对照管：I号为空白对照管，II号为同型抗体对照管（阴性对照）。实验管：按整合素α2，α3，α5，β1，β2分为5组，每组3管，结果取平均值。制备活性高的细胞悬液并调整细胞浓度为5×109～1×1010/L；取细胞悬液40μL加入所有对照管及实验管中，II号对照管中加入1 test（20μL）FITC标记的同型抗体，各实验管中加入40μL一抗(1∶50 )，然后各管加入1:20灭活正常羊血清50μL，轻轻吹打。置于4℃冰箱中孵育30min；用PBS洗涤2次，每次2mL左右，离心800r/min×5min；弃上清液，各实验管中加入FITC标记的二抗(1∶100)50μL，充分振摇。置于4℃冰箱中孵育30min；用PBS洗涤2次，每次2mL左右，离心800r/min×5min；加10g/L多聚甲醛固定液0.5～1mL；上流式细胞仪检测。
图1 人晶状体上皮细胞株SRA01/04各整合素流式细胞检测的表达（略）
统计学处理：用SPSS 13.0 for windows统计软件对各组数据进行χ2检验。
2结果
人晶状体上皮细胞株SRA01/04表达整合素α2，α3，α5，β1及β2，阳性表达率分别为85.3％，97.6％，74.0％，97.7％，3.65％，其中整合素β1和α3表达率最高，其次为α2和α5，最低为β2。同型对照管与空白对照管相比无统计学差异（χ2检验，P＝0.3443）。各整合素实验管（α2，α3，α5，β1和β2）阳性表达率均明显高于同型对照管（χ2检验，P<0.01）。整合素α3与β1之间阳性表达率比较无统计学差异（χ2检验，P＝0.737），其余两两间比较均有显著统计学差异（χ2检验，P<0.01，表1，图1）。
3讨论
整合素是一类由粘附分子中α亚单位和β亚单位以非共价键连接而成的异二聚体跨膜蛋白，是广泛表达于多种细胞并介导细胞与细胞、细胞与间质之间相互作用的一种细胞表面受体[9]。目前已知至少有16种α亚单位和11种β亚单位，组成20多种不同的整合素，例如整合素α1β1，α2β1，α3β1和αⅤβ3主要为胶原蛋白受体；αⅤβ1，αⅤβ3和αVβ5为粘连蛋白受体；α4β1，α3β1，αVβ3，αVβ6，α5β1和αIIbβ3为纤维粘连蛋白受体；α2β1、α1β1，α3β1，α6β1和α7β1为层粘连蛋白受体[10]。整合素细胞内区与胞浆内肌动蛋白细胞骨架相连，细胞外区与基质蛋白或其他细胞上的特异性配体的精甘天冬氨酸（argglyasp，RGD）结构结合，从而将细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和细胞骨架连接起来，引起细胞内一系列生化改变，进而影响多种组织细胞功能的调控[4，11，12]。大多数ECM（如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、波形蛋白、Ⅳ型胶原等）含有RGD序列，整合素通过α，β亚单位识别ECM中的RGD序列，介导细胞粘附、影响细胞分化和增殖。
表1 人晶状体上皮细胞株SRA01/045种整合素的阳性表达率（略）
bP<0.01 vs同型对照管
整合素广泛表达于多种细胞。近年来有研究表明，人晶状体上皮细胞表面亦表达多种整合素，可能对LEC的粘附、移行及增殖起促进作用，从而导致PCO的发生[37]。Zhang等[3，8]对100例白内障摘除术患者的晶状体前囊膜上皮细胞行免疫组化检查，发现整合素α2，α3，α5，β1，β2在原位呈阳性表达，表达率分别为70%，65%，75%，70%和80%。Mathew等[4]用同样的方法对28例白内障术后标本进行检查，发现整合素α2，α3，α5，β2的阳性表达率分别为33%，75%，33%，20%，且二聚体α3β1在晶状体囊的周边细胞表达异常增多。一些研究还发现，人晶状体上皮细胞株SRA01/04和HLEB3亦表达不同的整合素[6,7]。以上研究证实了人晶状体细胞相应整合素的存在，但采用的方法均为免疫组化法，容易产生实验偏差。我们应用流式细胞仪对来自同一群的单个SRA01/04细胞逐一检测不同整合素的表达，具有更高的灵敏性、客观性和准确性。结果发现，整合素α2，α3，α5，β1，β2在人晶状体上皮细胞株SRA01/04呈阳性表达，其中β1（97.7％）和α3（97.6％）的表达率最高，其次为α2（85.3％）和α5（74.0％），β2（3.65％）的表达率最低。α3β1为可能的二聚体，α3和β1的高表达提示增殖的LEC优先表达大量的整合素α3β1，而α3β1为胶原蛋白、粘连蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等多种ECM的受体[7]，其表达增加可能在PCO的形成中起较为关键的作用。有研究用RGD肽及某些蛇毒去整合素封闭β1整合素位点，可抑制细胞的粘附及移行[13,14]。Nishi等[8，15]用抗整合素β1抗体，可以阻断LEC的粘附、移行和增殖。α5β1和α2β1亦为可能的二聚体，α5β1是纤维粘连蛋白受体，Menko等[16]发现晶状体周边及赤道部上皮细胞表达整合素α5β1，该整合素可与纤维粘连蛋白识别并结合，调节LEC的粘附与增殖。α2β1主要为胶原蛋白受体和层粘连蛋白受体。由此推测整合素α5β1和α2β1在LEC的粘附及移行中也可能发挥重要作用。β2的表达率较低，其在细胞的粘附、增殖、移行过程中的作用有限。
PCO是白内障囊外摘除或超声乳化吸出联合人工晶状体植入术后的主要并发症之一，可导致术后视力再度下降。Schaumberg等[13]报道白内障术后 1，3，5a后囊膜混浊的发生率分别为 11.8%，20.7%，28.5%。PCO发生的主要机制为残留的LEC增生、迁徙、分化以及胶原和基底膜样物质形成，而LEC的增生、迁徙基于ECM蛋白与细胞受体整合素的相互作用，整合素在与ECM蛋白结合时，细胞外信号传至细胞内，激活细胞内蛋白磷酸化，从而导致细胞骨架和跨膜基因表达发生改变。在白内障术后，残留的LEC在创伤修复过程中可合成I，III和IV型胶原[17]，同时由于血房水屏障破坏，这些ECM蛋白极易在后囊膜上沉积，成为LEC生长繁殖的支架，促进LEC的粘附和迁移[8，18]。我们最近的研究[19]发现，去整合素Kistrin能显著抑制体外培养人LEC的粘附及移行，反过来证实整合素在PCO的发病机制中起重要作用。整合素的高表达，可能在白内障术后LEC增生、迁徙、分化的过程中起关键作用。因此，通过药物降低整合素的表达从而抑制LEC增生、迁徙、分化，可能成为防治后发性白内障的一条有效途径。
【参考文献】
1 Wang XL, Yu T, Zhang GG, et al. Effect of bFGF on expression focal anhesion kinase in human lens epithelial cells. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) 2007;7(2):336338
2 Wang YD,Zhang JS.β1integrin overexpression induces the ability of adhesion and migration of rabbit corneal epithelial cells. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) 2008;8(3):499501
3 Zhang XH, Ji J, Zhang H, et al. Detection of integrins in cataract lens epithelial cells. J Cataract Refract Surg 2000;26(2):287291
4 Mathew MR, Mclean SM, Murray SB, et al. Expression of CD18,CD49b,CD49cand CD49e on lens anterior capsules in human cataracts. Eye 2003;17(4):473477
5 McLean SM, Mathew MR, Kelly JB, et al. Detection of integrins in human cataract lens epithelial cells and two mammalian lens epithelial cell lines. Br J Ophthalmol 2005; 89(11):15061509
6 Oharazawa H, Ibaraki N, Lin LR, et al. The effects of extracellular matrix on cell attachment, proliferation and migration in a human lens epithelial cell line. Exp Eye Res 1999;69(6): 603610
7 Lim JM, Kim JA, Lee JH, et al. Downregulated expression of integrin alpha6 by transforming growth factorbeta(1) on lens epithelial cells in vitro. Biochem Biophys Res Commun 2001;284(1):33 41
8 Bai F, Qin L, Li XH. The current study status of integrin and disintegrin in posterior capsular opacification. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) 2006;6(1):149151
9 Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science 1995;268(5208):233239
10 Cheresh DA. Integrins: structure, function, and biological propenies. Adv Mol Cell Biol 1993;6:225231
11 Elner SG, Elner VM. The integrin superfamily and the eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996;37(5):696701
12 Du Q,Zhou J,Hui YN, et al. Effect of high glucose on the expression of integrinlinked kinase in human lens epithelial cells. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) 2008;8(4):676678
13 Shiokawa S, Yoshimura Y, Sawa H, et al. Functional role of argglyasp (RGD) binding sites on beta1 integrin in embryo implantation using mouse blastocysts and human decidua. Biol Reprod 1999;60(6):14681474
14 Eble JA, Bruckner P, Mayer U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting lamininbinding beta1 integrins. Biol Chem 2003;278 (29):2648826496
15 Nishi O, Nishi K, Akaishi T, et al. Detection of cell adhesion mole cules in lens epithelial cells of human cataracts. Invest Ophthalmol Vis Sci1997;38(3):579 585
16 Menko S，Philp N，Veneziale B, et al. Integrins and development:how might these receptors regulate differentiation of the lens. Ann NY Acad Sci 1998;842:3641
17 Ishibashi T, Hatae T, Inomata H. Collagen types in human posterior capsule opacification. J Cataract Refract Surg 1994;20(6):643646
18 Olivero DK,Furcht LT.Type IV collagen, laminin, and fibronectin promote the adhesion and migration of rabbit lens epithelial cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34(10):28252834
19谭少健,梁皓,赵军,等.去整合素抑制体外培养的人眼晶状体上皮细胞生长的研究.广西医科大学学报2006;23(3):348351
订阅登记：
请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息，感谢您浏览首席医学网！