survivin反义寡核苷酸转染对人乳腺癌细胞系MCF7生长及对长春瑞滨的增敏作用
【摘要】 目的 探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）对乳腺癌细胞系MCF7的诱导凋亡、抑制增殖和对长春瑞滨的增敏作用。方法 采用脂质体介导survivin ASODN转染乳腺癌细胞系MCF7，半定量RTPCR方法检测survivin基因mRNA表达，Western blot方法检测survivin基因蛋白表达，AnnexinⅤ/PI双染法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率变化，PI染色通过流式细胞仪检测细胞周期时相变化，MTT比色法检测转染细胞的生长抑制情况及对长春瑞滨的敏感性,电镜观察反义转染对乳腺癌细胞系MCF7的凋亡诱导作用。结果 survivin反义复合物下调MCF7细胞的survivin mRNA和蛋白表达，并呈剂量依赖性。细胞周期被阻滞于G2/M期，细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），反义组细胞生长抑制率明显上升（P＜0.05）。透射电镜下转染组细胞呈凋亡晚期变化。600?nmol/L反义转染组长春瑞滨的IC50值为(3.7±0.42)μg/mL,正常组为(7.1±0.68)μg/mL,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 survivin反义寡核酸可有效下调MCF7的survivin mRNA及蛋白表达水平,抑制增殖，诱导凋亡，并增强其对化疗药物长春瑞滨的敏感性。
【关键词】 乳腺肿瘤；survivin 寡核苷酸类,反义；增殖；凋亡；长春瑞滨
HU Yu, LI Li, LI Lizhen
(Cancer Center, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)
To explore the effects of survivin antisense oligonucleotide(ASODN) on apoptosis, growth and sensitivity to vinorelbine in the human breast cancer cell MCF7. Methods SurvivinASODN was transfected into the MCF7 cells mediated by the Lip reagent. Expression of survivin mRNA was determined by RTPCR and of survivin protein by Western blot. Apoptosis rate and cell cycle changes in antisense oligonucleotide(ASODN) transfected cells were detected by FCM. Cell proliferation and chemosensitivity to vinorelbine in MCF7 were determined by the MTT assay. The effect of survivin antisense oligonucleotide(ASODN) in inducing apoptosis of MCF7 cells was observed under an electron microscope. Results Survivin ASODNLip compound efficiently downregulated the mRNA and protein expressions of survivin in MCF7 cell lines in a concentrationdependent manner. The cell cycle was arrested at the G2/M phase， the cell apoptosis rate was increased obviously(P＜0.05), and growth inhibition was evidently increased in antisense oligonucleotide(ASODN) transfected cells（P＜0.05）. Terminal apoptosis changes were observed under an electron microscope after antisense oligonucleotide(ASODN) transfection. The 50% inhibitory concentration(IC50) of vinorelbine was significantly lower for 600?nmol/L antisense oligonucleotide(ASODN) transfected MCF7 cells than for control cells ［(3.7±0.42)μg/mL Conclusion Survivin
Key words: Breast neoplasms; Survivin oligoribonucleotides,antisense; Cell proliferation; Apoptosis; Vinorelbine 抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡，提高细胞毒药物的敏感性是目前提高乳腺癌治疗效果的重要措施。survivin是近年来发现的凋亡蛋白抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins,IAPs）家族成员,呈G2/M期周期特异性的高表达于乳腺癌组织,而在正常乳腺组织中无表达。survivin能够通过抑制Caspase级链反应下游的凋亡核心Caspase3、Caspase7,从而阻断细胞生长于G2/M期，在细胞凋亡和周期的基因调控中发挥重要作用［1］。本实验通过ASODN转染技术抑制乳腺癌细胞系MCF7的survivin表达及对MCF7细胞的凋亡诱导、生长抑制及对长春瑞滨的增敏作用，探讨提高乳腺癌疗效的新路径。
1 材料与方法
1.1 主要材料 人乳腺癌细胞系MCF7由山东省肿瘤医院基础研究所提供。脂质体Lipofectamine2000及Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品。引物、寡核苷酸、RTPCR试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。AnnexinV/PI凋亡试剂盒及PI染液购自晶美生物工程有限公司。长春瑞滨由江苏豪森药业股份有限公司提供（批号：070503）。MTT购于美国Sigma公司。一抗及βactin购自Santa Cruz生物技术公司。Marker DL2000购自MBI公司。辣根过氧化物酶标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 MCF7细胞常规培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 脂质体（Lip）介导的寡核苷酸（ODNS）转染 ASODN序列为:5＇cccagccttccagctccttg3＇,SODN序列为:5＇caaggagctggaaggctggg3＇,每条序列两端各5个磷酸基用硫代磷酸修饰。实验分6组：正常组,脂质体对照组（Lip）,600?nmol/L SODN组(S600),200?nmol/L ASODN组(A200),400?nmol/L ASODN组(A400),600?nmol/L ASODN组(A600)。转染前1?d,将MCF7细胞以2×105/mL的密度种于6孔板。按照Lipofectamine2000说明书配制上述不同浓度的LipODNS复合物进行转染。
1.2.3 半定量RTPCR法检测survivin mRNA表达 收集转染48?h后的各组细胞。按Trizol试剂说明书步骤提取总RNA,以紫外分光光度法行总RNA定量。取2?μg总RNA用MMLV逆转录酶进行逆转录。PCR扩增survivin,上游引物序列:5＇gagctgcaggttccttatc3＇,下游引物序列:5＇acagcatcgagccaagtcat3＇。扩增片断为431?bp。同时扩增βactin作内参照，βactin的上游引物序列:5＇cgggacctgactgactacct3＇,下游引物序列:5＇aagcatttgcggtgga3＇,扩增片断578?bp。扩增条件:逆转录50?℃ 30?min，94?℃预变性3?min,94?℃30?s,65?℃30?s,72?℃1?min,30个循环,末循环72?℃5?min。RTPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙锭染色,照片由凝胶图像分析系统分析,以对应survivin与βactin积分光密度比值作survivin mRNA相对表达水平。
1.2.4 Western Blot法检测survivin蛋白表达 各组细胞培养48?h,按分子克隆手册提取总蛋白定量。取每种样品各20?μL,进行Western Blot检测survivin蛋白表达，βactin作内对照。按ECL化学发光试剂说明书检测条带，图像分析系统分析结果,以相应蛋白条带积分吸光度值表示蛋白表达的相对强度。结果以survivin与βactin蛋白表达量的比值表示。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期分布时相 细胞分4组：正常组、Lip、S600、A600，接种于6孔板,转染48?h后,每组收集106个细胞,4?℃预冷PBS洗涤2次,加入预冷70%乙醇吹打，4?℃过夜固定,每组加300?μL含RNA酶的PI染液室温染色30?min,流式细胞仪检测细胞周期分布。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率 细胞分4组(同1.2.5),接种于24孔板,转染48?h后,每组收集至少105个细胞,加AnnexinV 5?μL，避光室温染色15?min,再加入10?μL PI染液避光室温染色5?min,上机检测。
1.2.7 MTT比色法检测MCF7细胞转染后的生长抑制率 转染24?h后，将各组中贴壁存活的细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板,每组设5个复孔,分别培养24、48、72?h,每孔加入MTT溶液(5?mg/mL)20?μL,4?h后结束弃上清,每孔加入DMSO 150?μL,放入酶标仪振荡15?s，测定490?nM处的A值。细胞生长抑制率(%)=(1-A实验组/A正常组)×100%。
1.2.8 电子显微镜观察细胞超微结构 各组细胞培养48?h后,收集1×106个细胞,PBS漂洗3次,离心后置于1.5?mL eppendorf管中戊二醛4?℃固定,铀和铅染色电镜下观察细胞超微结构。
1.2.9 MTT比色法检测转染前后MCF7细胞对长春瑞滨的敏感性 分别取各组对数生长期细胞接种于96孔板,每孔加入密度为1×105/mL的细胞100?μL,每组设7孔。24?h后，其中1孔用作调零,其余6孔加入含有长春瑞滨的培养基，药物终浓度依次为0,2,4,6,8,10(μg/mL),37?℃培养24?h后,每孔加入MTT溶液(5?g/L)20?μL,4?h后结束弃上清,每孔加入DMSO 150?μL,放入酶标仪振荡15?s，测定490?nM处的A值。细胞存活率(%)=(A实验组/A对照组)×100%。根据A值计算细胞存活率及长春瑞滨作用的半数抑制浓度（IC50）。
1.2.10 统计学处理 采用SPSS11.0软件包进行t检验和方差分析,所有实验重复3次，结果检验标准α=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 转染survivin ASODN对MCF7细胞survivin mRNA表达的影响 见图1。ASODN转染MCF7细胞48?h后,正常组高表达survivin mRNA，ASODN转染组的PCR产物电泳带较正常组明显减弱,且呈浓度依赖趋势。Lip和S600的survivin mRNA水平无明显变化，各组βactin表达不受影响。应用图像分析软件进行光密度分析，survivin ASODN可下调其mRNA表达,A200、A400、A600分别下调至80.24%、68.52%、49.17%。与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。Lip、S600与正常组相比,差异无统计意义(P＞0.05)。
2.2 转染survivin ASODN对MCF7细胞survivin蛋白表达的影响 见图2。与正常组相比,ASODN转染组survivin蛋白表达明显下降，且呈浓度依赖趋势。应用图像分析软件进行条带积分光密度分析,A200、A400、A600分别下调至75.14%、61.09%、29.73%。与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。Lip、S600组与正常组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.3 转染survivin ASODN对MCF7细胞周期分布和细胞凋亡的影响 见表1。A600细胞发生细胞周期阻滞,48?h主要阻滞于G2/M期,G2/M期占41.63%,与对照组相比较差异有统计学意义（P＜0.01)。A600细胞凋亡率较高,凋亡率达(18.39±1.06)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.4 转染survivin ASODN对MCF7细胞生长抑制率的影响 见图3。ASODN转染组细胞生长抑制率明显升高，与对照组相比有统计学意义(P＞0.05)；并且ASODN呈时间、浓度依赖性抑制MCF7细胞的增殖,A200、A400、A600 48?h的增殖抑制率分别为35.25%、46.41%和60.36%;A600的24、48和72?h的增殖抑制率分别为29.05%、60.36%和69.08%，差异有统计学意义(P＜0.05)。
MTT比色法示在转染后不同时间各组MCF7细胞的生长抑制情况
2.5 电镜观察超微结构 见图4。电镜下A600细胞大部分呈凋亡晚期变化,细胞核收缩变圆,与周围细胞脱离,微绒毛消失,胞质浓缩,细胞核中染色质边集、皱缩成块状并向细胞膜扩散,密度增高,核离散。而对照组无上述表现。
2.6 survivin ASODN增加MCF7细胞对长春瑞滨的敏感性 各组细胞随着长春瑞滨浓度的提高,细胞存活率都呈下降趋势,但ASODN转染组下降更加明显,A200、A400、A600的IC50值分别为（5.1±0.52）μg/mL,（4.6±0.57）μg/mL,（3.7±0.42）μg/mL；而S600、Lip和正常组分别为（6.6±0.74）μg/mL和（6.8±0.81）μg/mL,（7.1±0.68）μg/mL，相比ASODN组的IC50值明显下降,方差分析差异有统计学意义(P＜0.05)。
3 讨 论
survivin与肿瘤细胞有丝分裂和凋亡的调控、以及某些化疗药的耐药密切相关［2］。在包括乳腺癌在内的多种肿瘤组织中广泛表达,且呈特异性表达于细胞G2/M期,作用于多种细胞周期调节因子和有丝分裂纺锤体微管,survivin基因的周期特异性高表达可能使乳腺癌细胞趋于逃避G0/G1期和G2/M期的复杂分子检测机制而抑制凋亡。其过度表达可能导致肿瘤细胞耐药,并可能是预后不良的因素之一［3］。ASODN可用来特异性封闭凋亡抑制基因，从而抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡并增强其化疗敏感性［4］。survivin的组织特异性表达，使抑制survivin基因的表达不会对整个机体造成过大的影响，其对细胞增殖和凋亡的双重作用，使其成为肿瘤基因治疗研究的一个理想靶目标。
Choi等［5］研究结果显示，腺病毒载体转染MCF7后，survivin mRNA分别下降74%和73%,蛋白表达相应下调。Mesri等［6］利用survivin突变体质粒转染MCF7后也能下调survivin mRNA和蛋白的表达量,从而诱导细胞凋亡。本实验采用硫代修饰增加寡核苷酸稳定性,并通过脂质体介导寡核苷酸转染,增加了寡核苷酸转染效率。结果显示,survivin ASODN明显抑制survivin基因 mRNA和蛋白表达并呈现剂量依赖性趋势，说明survivin ASODN的抑制作用具有特异性,同时也提示转染成功。
Yamamoto等［7］在研究中发现：阻断survivin基因的表达, 可以抑制肿瘤细胞的增殖和集落形成能力。另有研究表明，与脂质体空白对照组比较,经survivin ASODN作用后的细胞生长受到明显的抑制,凋亡率增加(P＜0.05)［8］。韩芳等［9］转录survivin基因，使细胞周期紊乱，生长停滞于G2/M期，同时诱导凋亡增加。本实验采用流式细胞术检测反义转染细胞凋亡率及细胞周期时相变化，显示反义转染组细胞发生细胞周期阻滞，并主要阻滞于G2/M期；同时诱导MCF7细胞凋亡，对凋亡的诱导有明显剂量依赖性，600?nmol/L ASODN作用于MCF7细胞48小时后,凋亡率为18.39%。另外，本实验在传代培养48小时细胞增殖最旺盛时电镜下观察各组细胞的超微结构,可以看到A600大部分细胞呈凋亡晚期变化,而S600、Lip和正常组则没有类似改变。以上结果显示,survivin ASODN转染MCF7细胞后对survivin基因表达的阻断及对MCF7细胞的生长抑制及凋亡诱导的作用是确切的。
本实验采用MTT比色法发现survivin ASODN能明显抑制MCF7细胞的生长，并且MCF7细胞转染后的生长抑制率呈明显时间、浓度依赖性。
在恶性肿瘤中,凋亡抑制基因的过度表达导致凋亡抑制,并与化疗耐药相关。Chandele等［10］研究显示,survivin基因的高表达与乳腺癌的不良预后及耐药性密切相关,抑制survivin基因的表达能增加肿瘤组织对化疗的敏感性。Ikeguchi等［11］研究认为survivin在胃癌细胞中可能起着抵制化疗的作用。Muenchen等［12］研究证实survivin的表达阻断了PC3细胞中的半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶Caspase3和Caspase7的活性,同时保护肿瘤细胞不受抗肿瘤药物的影响。长春瑞滨（vinorelbine,NVB）系周期特异性细胞毒药物，细胞微管蛋白和微管是其作用靶点，它是治疗乳腺癌的有效药物之一，单药有效率大于35%。本研究中MTT比色法结果显示,ASODN转染组长春瑞滨的IC50值明显下降，而正常组、Lip和S600长春瑞滨的IC50值变化不大。提示下调survivin ASODN mRNA及蛋白表达与长春瑞滨联合应用,可抑制MCF7细胞生长,有望增加化疗敏感性,克服肿瘤耐药性。
综上所述，反义转染MCF7细胞，封闭了survivin基因表达，对MCF7有抑制增殖、诱导凋亡、化疗增敏作用，实验丰富了survivin反义基因治疗的临床前研究。同时发现转染survivin ASODN能增加MCF7对细胞毒药物的敏感性，进一步证实survivin基因有可能成为乳腺癌治疗的一个理想靶点，对相关基因治疗与化疗协同应用打下基础。
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