牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜VEGF，TSP1的实验研究
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首席医学网
2009年03月17日 10:47:29 Tuesday
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作者：石岱远，李穆，陈志伟 作者单位：1（115200）中国辽宁省盖州市中心医院眼科；2（111000）中国辽宁省辽阳市眼科医院；3（161006）中国黑龙江省齐齐哈尔市，黑龙江齐齐哈尔医学院
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【摘要】 目的：观察糖尿病大鼠视网膜病变,探讨牛磺酸对糖尿病大鼠VEGF，TSP1的影响。方法：选择健康成年SD大鼠30只,随机分成正常对照组，糖尿病组，牛磺酸组。一次性腹腔内注射链尿佐菌素(STZ),建立糖尿病大鼠模型,在普通饲料中加12g/L牛磺酸进行营养干预,采用免疫组化SABC法，对视网膜上VEGF，TSP1进行研究。对各组视网膜因子表达情况进行图像分析。结果：与糖尿病组比较,牛磺酸组视网膜VEGF蛋白质的阳性表达降低；TSP1蛋白质阳性表达升高,差别显著。结论：牛磺酸可明显改善糖尿病视网膜的VEGF，TSP1的表达。
【关键词】 牛磺酸；糖尿病视网膜；VEGF；TSP1
Effect of taurine on VEGF, TSP1 of rats with earlystage diabetic retinopathy
DaiYuan Shi, Mu Li, ZhiWei Chen
1Department of Ophthalmology, Central Hospitall, Gaizhou 115200, Liaoning Province, China;
2Department of Ophthalmology, Eye Hospital, Liaoyang 111000, Liaoning Province, China;
3Qiqihar Medical College, Qiqihar 161006, Heilongjiang Province, China
AbstractAIM: To observe retinopathy of diabetic rats and to investigate the effect of taurine on VEGF, TSP1 of rats with earlystage diabetic retinopathy.METHODS: Thirty SD rats were chosen and randomly divided into normal group, diabetic group and taurinetreated diabetic group. Diabetic rats were induced by injected streptozocin into abdominal cavity once and were treated with taurine (12g/L) that were mixed with food. Three months after the models being created, retinal tissues of rats were observed with optical microscope, SABC to detect WEGF and TSP1.RESULTS: Compared with diabetic group, the expression of WEGF was obviously decreased, while TSP1 expression was significantly increased in taurinetreated diabetic group.CONCLUSION: Taurine can effectively protect retinal capillaries and improve the expression of WEGF and TSP1.
KEYWORDS: taurine; diabetic retina; WEGF; TSP1
0引言
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的主要并发症之一,几乎所有糖尿病病程达15a以上的患者均出现一定程度的视网膜病变,牛磺酸是视网膜中含量最丰富的游离氨基酸,是视网膜发育必需的营养因子,研究人员发现糖尿病视网膜中牛磺酸含量减少,补充牛磺酸可以防治糖尿病视网膜病变。为探讨牛磺酸对糖尿病视网膜病变的防治作用,我们观察了其对糖尿病视网膜VEGF，TSP1的影响。
1材料和方法
1.1材料
实验用封闭群SD大鼠30只,雌雄不限，体质量220～250g,自然昼夜光线照明。动物随机分为3组：正常对照组、糖尿病组、牛磺酸组，每组10只。大鼠正常组及糖尿病组饲以标准饲料,牛磺酸干预组的饲料在标准饲料中加入12g/L牛磺酸,牛磺酸购自北京世纪维他保健品公司;兔抗小鼠VEGF单克隆抗体中山生物技术有限公司,山羊抗小鼠TSP1单克隆抗体美国NeoMarkers公司,阳性对照片：为人乳腺癌的VEGF和TSP1免疫组化染色片,中山生物技术有限公司,SP9002免疫组织化学试剂盒中山生物技术有限公司,DAB显色试剂盒武汉博士德生物技术有限公司。
1.2方法
实验前大鼠禁食12h,自由饮水用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ,Sigma公司)诱导糖尿病,临用前用0.1mmol/L的柠檬酸缓冲液(pH4.5)配制成10g/L的STZ溶液,按60mg/kg一次性左下腹腔注射,注射后72h检测定性尿糖和血糖,用尿糖试纸测尿糖达+++以上,尾静脉采血测血糖浓度>6.7mmol/L即为模型建立成功[1]。实验期间测血糖，1次/mo,各组动物3mo后，4℃预冷的40g/L聚甲醛灌注固定大鼠,取大鼠左眼球于40g/L多聚甲醛后固定4～6h,300g/L蔗糖4℃过夜,冰冻切片将视网膜中部(即贯穿视神经)的切片取3张,采用免疫组化SABC法测定VEGF，TSP1的表达。
统计学分析：数据以均数±标准差（±s）表示，采用SAS 8.0统计学软件进行t检验，P＜0.05为差异有显著性。
2结果
结果判定标准：阳性细胞为胞质呈黄色。各组各时相点分别取6张切片，每张切片在光镜×200放大条件下随机采集阳性染色最强的6个视野（即每只动物15帧测试图像），输入计算机后应用ImagePro Plus图像分析系统测定视网膜VEGF和TSP1的积分光密度，平均积分光密度值越大，染色越深，反映细胞内蛋白免疫活性（表达量）越高。正常组大鼠VEGF阳性反应在视网膜分布于内核层及节细胞层，胞质呈棕黄色，胞核未显色。模型组视网膜VEGF蛋白质的阳性表达分布于内核层及节细胞层，表达增强，胞质呈深棕黄色，内核层阳性反应细胞增多；模型组大鼠视网膜TSP1蛋白质的阳性表达较正常组显著降低，在内丛状层、外丛状层呈极微弱的阳性表达。给药组明显提高TSP1和降低WEGF的表达（表1）。表1 VEGF，TSP1在正常组和糖尿病组视网膜中表达的图像分析结果（略）
3讨论
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的主要并发症之一。近年来的研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）和血小板反应蛋白1(TSP1)是目前较为重要的血管刺激因子和抑制因子，它们的作用在生理性和病理性的眼底新生血管生成过程中起着关键作用[2]。牛磺酸学名称是2氨基已磺酸，占视网膜中氨基酸总量的50%。是一种人体必需的非蛋白质氨基酸,具有多种生理功能,维持细胞内外渗透压平衡,清除氧自由基。抗脂质过氧化损伤,调节细胞钙稳态,直接膜稳定作用。VEGF是促血管生长因子，通过它可以改变血管新生的一些重要过程。与经典的多肽类激素不同，VEGF主要是以旁分泌和自分泌的方式起作用[3]。TSP1可能是通过抑制内皮细胞增殖，在体外可以直接抑制兔黄体、牛肾上腺皮质、肺动脉以及人脐静脉的内皮细胞增殖，这种抑制作用可被抗TSP1的单克隆抗体所中和[4,5]。在实验中我们发现，VEGF免疫阳性反应在正常大鼠视网膜中表达较弱，且局限于视网膜内核层及节细胞层的部分细胞的胞质，而糖尿病大鼠中VEGF蛋白质的阳性表达较正常对照组大大增强，视网膜VEGF蛋白质的阳性表达明显增强，其差异具有显著性。TSP1免疫阳性反应在正常大鼠视网膜中表达较强，主要表达于内界膜、内丛状层、内核层、外丛状层。而在STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中，TSP1蛋白质的阳性表达比正常大鼠减弱。药物组中VEGF的表达降低较糖尿病组明显，比较有差异。药物组中TSP1的表达均升高，而药物组中TSP1的表达升高较糖尿病组明显，比较有差异。在药物干预后VEGF和TSP1的表达均有变化，这更提示了二者共同参与了糖尿病视网膜病变的病程。考虑可能减轻或阻止视网膜微血管的渗漏，减少血管活性物质的合成，从而抑制血管活性物质的作用，预防血管内皮细胞收缩和间隙形成，阻止微血管基底膜增生，它能抑制血小板聚集因子的合成和释放，抑制二磷酸腺苷引发的栓形成。它们的表达失衡可能在DR的病变形成过程中起重要调控作用，二者之间的调控机制及相互作用关系目前还不清楚，本文只作了初步的探索，需更多的研究来加以完善。
【参考文献】
1魏泓.医学实验动物学.第2版.成都：四川科学技术出版社 2001:5
2郝胜利,徐延山,袁佳琴.糖尿病视网膜病变的药物治疗.国际眼科纵览 2006;30(1):5862
3陈子林,杨华胜,杨清绪,等.眼肿瘤患者组织中血管内皮生长因子、血小板反应素及微血管计数的表达.中国基层医药 2004;11(3):309310
4 Wu Z, Wang S, Sorenson CM, et al. Attenuation of retinal vascular developmentand neovascularization in transgenic mice overexpressing thrombospondin1 in thelens. Dev Dyn 2006;235(7):19081920
5 Uno K,Bhutto IA,McLeod DS, et al. Impaired expression ofthrombospondin1 ineyes with age related macular degeneration. Br J Ophthalmol 2006;90(1):4854
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