SD大鼠暗视阈值反应波形记录的特征
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首席医学网
2009年04月08日 16:43:44 Wednesday
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作者：刘兰涛 郭 群 夏 峰 张作明 作者单位：（710032）中国陕西省西安市，第四军医大学航空航天医学系航临教研室
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【摘要】 目的：研究SD大鼠暗视阈值反应（scotopic threshold response, STR）的特点。 方法：SD大鼠21只，随机分成3组，每组7只，完全暗适应12h，麻醉后采用RETIport系统(Roland Consult ,德国)分别记录不同通频带（0.1～50，0.1～100，0.1～300，1～50，5～50Hz），不同刺激频率（0.25，0.50，0.75，1，2Hz）,不同闪光强度（ 6.3， 6.0， 5.7，5.4log(cd·s)/m2）下的STR。结果：本实验条件下可以记录到稳定的STR，分为正向的pSTR和负向的nSTR。通频带对STR有影响，随着高频段的增大，附加在波形上的杂波比较多，pSTR和nSTR潜伏期和振幅变化不明显。随着低频段升高，nSTR逐渐消失，尤其是低频段达到5Hz时，振幅有显著差异（P<0.05）。刺激频率小于1.0Hz时，pSTR和nSTR波形比较稳定，而且nSTR振幅和潜伏期没有明显差异。当刺激频率大于2Hz时，负向波消失，并且正向波振幅明显升高（P<0.05）。随着刺激光强的增加，pSTR振幅增大，尤其是在光强为5.7，5.4log(cd·s)/m2时，振幅有显著差异(P<0.05)，nSTR逐渐平坦消失，未见a波。 结论：SD大鼠STR波形记录与刺激和记录参数密切相关，在完全暗适应条件下，低光强刺激（6.3和6.0 log(cd·s)/m2）、低通带（0.1～50Hz）、适当刺激频率（<1Hz）下可以记录到完整的稳定的STR波形。
【关键词】 暗视阈值反应 SD大鼠 波形记录
0引言
暗视阈值反应（scotopic threshold response, STR）是在完全暗适应下，很弱刺激光强记录到的潜伏期很长、振幅很小的负向波。它是由Sieving 等[1]在1986年记录暗适应猫眼实验中首次报道的，它不同于视网膜电图的a波和b波，因此命名为STR。但是关于STR的基础研究比较少，我们研究不同条件下的STR的变化特点和规律，以期为以后深入的研究STR以及不同视网膜疾病下STR变化提供理论依据。图1 不同通频带下典型的STR波形表1 不同通频带下pSTR和nSTR的潜伏期和振幅变化
1对象和方法
1.1对象 实验动物为SD雄性大鼠21只，由第四军医大学动物实验中心提供，体质量在180～250g，外眼和检眼镜查屈光间质清晰，眼底无改变，不限食水，12h明暗交替，18～23℃条件下适应性饲养3d后进行实验。
1.2方法 将21只SD雄性大鼠随机分成3组（通频带组、刺激频率组、刺激光强组），每组7只。根据小鼠与大鼠视网膜电图和闪光视觉诱发电位记录标准化方案建议[2]，将SD大鼠完全暗适应12h,在红光下用速眠新Ⅱ注射液 (由军事医学科学院军事兽医研究所提供) 0.60mL/kg ip麻醉。将动物固定于特制实验台上,安放记录电极、参考电极和接地电极。记录电极由直径0.2mm的圆形银丝制成,中间为环形,环形两侧各留一柄,便于固定。参考电极和接地电极用不锈钢针制成[3]。记录前用5g/L托品酰胺散瞳,角膜表面滴加10g /L甲基纤维素,再放置并固定角膜电极,参考电极置于大鼠颊部，接地电极位于鼠尾。每组随着刺激频率以及刺激光强的增加，间隔时间逐渐延长。采用RET Iport系统(Roland Consult,德国)以及自制LED点光源小动物闪光ERG刺激器[闪光时间3ms,最低刺激光强为 4.5 log(cd·s)/m2]分别在不同衰减率的中性减光片（Kenko filters, Japan）下记录不同通频带（0.1～50，0.1～100，0.1～300，1～50，5～50Hz），不同刺激频率（0.25，0.50，0.75，1，2Hz），不同光强（ 6.3， 6.0，5.7，5.4log(cd·s)/m2）下的STR。电阻小于5 kΩ。依据光强度从高到低，叠加次数在40次到60次之间[4]。
统计学处理：应用RET Iport软件分析nSTR和pSTR的潜伏期以及幅值，潜伏期以记录开始为准，振幅以水平基线为准。使用SPSS 12. 0统计软件进行数据统计,实验结果以±s表示。
2结果
2.1 SD大鼠波形特点在刺激光强为6.3log(cd·s)/m2，通频带为0.1～50Hz，闪光频率为0.25Hz时，SD大鼠的STR包含一个低幅度的正向波（pSTR）和一幅度比较大的负向波（nSTR）。此条件下pSTR的潜伏期为(113.6±2.2)ms，振幅为(4.0±0.5)μV，nSTR的潜伏期为(222.9±1.0)ms，振幅为(9.9±0.7)μV。
2.2通频带对SD大鼠STR波的影响 不同的通频带，STR波的变化程度不同,但都有着相同的趋势。当低频带一定时，SD大鼠STR随着频带的增宽和高频截止的升高，波形上附加的噪音伪迹增多。当高频段截止50Hz，低频带逐渐上升时（1，5Hz），可以发现STR波的正向波逐渐明显，负向波逐渐消失，并且波形上附加的噪音伪迹也增多（图1）。当低频一定时（0.1Hz），随着高频带的增加，pSTR和nSTR的潜伏期和振幅变化并不是很明显。不同的通频带对pSTR和nSTR波的潜伏期和振幅的影响差异没有统计学意义（P>0.05，表1）。当通频带位于低频段（0.1～50Hz）时，所引出的波形是最为平滑，稳定。但是当高频固定，低频段上升一个很小的幅度后（由0.1～50Hz上升到1～50Hz），nSTR几乎记录不到，尤其是到5～50Hz，记录到的只有一个正向波。1～50 Hz和5～50Hz时，两者之间潜伏期差异没有统计学意义（P>0.05），两者振幅之间差异有统计学意义（P<0.05）。所以，STR受低频段的影响要远远大于高频段的改变，尤其是振幅受到的影响要大于潜伏期。
2.3刺激频率对SD大鼠STR波的影响 在不同刺激频率下，对SD大鼠STR反应产生一定的影响。当刺激频率<1.0Hz时，SD大鼠的pSTR和nSTR波形比较明显，而刺激频率的增加不会增加噪音伪迹，并且随着刺激频率的增加，叠加的次数也逐渐减少。但是当刺激频率>2Hz时，只能引出正向波，负向波消失（图2）。刺激频率对STR的正向波和负向波有一定的影响。当刺激频率为0.25和0.5Hz时，pSTR的潜伏期差异没有统计学意义，当刺激频率上升到0.75Hz时，与0.5Hz相比，潜伏期差异有统计学意义（P<0.05），而刺激频率为0.75，1.0，2.0Hz时，两两之间潜伏期差异无统计学意义，但是，刺激频率对nSTR潜伏期的影响并不是很大，刺激频率为0.25，0.5，0.75，1.0Hz时，nSTR潜伏期两两之间差异没图2 不同刺激频率下典型的STR波形
图3 A：不同刺激频率下pSTR和nSTR潜伏期；B：不同刺激频率下pSTR和nSTR振幅
图4 不同刺激光强下典型的STR波形
有统计学意义（图3A）。当刺激频率小于1.0Hz时，pSTR和nSTR的振幅各个刺激频率之间差异无统计学意义，当频率提高到2.0Hz时，正向波振幅明显提高，与刺激频率0.25，0.5，0.75，1.0Hz比较，振幅差异均有统计学意义（P<0.05，图3B）。
2.4光强对SD大鼠STR波的影响 光强对波形的影响比较大，当光强分别为 6.3Log和 6.0log(cd·s)/m2时，均能够引出完整的pSTR和nSTR。但是，随着刺激光强的增加，nSTR成分逐渐抬高、消失，pSTR的幅度却明显抬高（图4）。在记录的光强下，并没有引出a波。因此，我们认为刺激光强还是在视杆细胞感受阈值之下。刺激光强对STR潜伏期和振幅有很大的影响。当刺激光强增加到5.4log(cd·s)/m2时，pSTR的潜伏期明显延后，与其他3组刺激光强比较，差异有统计学意义（P<0.05，图5A）。随着刺激光强的增加pSTR的振幅明显增大，尤其是光强达到5.7和5.4log(cd·s)/m2时，振幅与其他三者相比，差异均有统计学意义（P<0.05，图5B）。刺激光强为 6.3和 6.0log(cd·s)/m2时，nSTR的潜伏期和振幅差异没有统计学意义。
3讨论
暗视阈值反应（STR）是由Sieving等[1]首先在猫眼记录到的，他认为STR是来自视网膜近端的，不同于暗视视网膜电图的PⅡ的一个负波反应。但是，我们在大鼠的记录过程中，并没有观察到单纯的负波反应。这一现象同Bui 等[4]报道的一致。同时，同其他种类的动物也是一致的，比如人[5]、猴子[6]、小鼠[7]。因此我们认为pSTR和nSTR的感光阈值是接近的。但是，Naarendorp等[8]认为pSTR比nSTR有更高的感光阈值，这一不同点还有待于深入研究。
图5 A：不同刺激光强下pSTR潜伏期aP<0.01 vs其余刺激点；B：不同刺激光强下pSTR振幅aP<0.05 vs其余刺激点
关于STR的准确起源，到现在还没有完全明确。Sieving认为STR可能与近端视网膜神经元或者Müller细胞有关K＋的释放有关[1]。随着研究的深入，他们[9]发现STR受在黑暗中释放甘氨酸和GABA的神经元影响大，而这些神经元大多都是视网膜的第三级神经元。Vzegan等[10]用不同剂量的2羟甲基3异丙烯基脯氨酸和N甲基D天(门)冬氨酸对猫视网膜电图不同成分的影响研究，认为STR和PERG产生的部位十分接近。由于产生PERG的结构是神经节细胞层，所以STR产生的部位也是十分接近神经节细胞层。而国内学者范先群等[11]采用激光光凝制成猫视网膜神经节细胞萎缩的模型，然后进行STR的测定，记录到正常的STR，说明STR的起源与神经节细胞无关。在猫眼存在的这种差异还有待于深入研究。但是Bui等[12]在研究大鼠神经节细胞在视网膜电图中所起的作用时，他们发现STR直接依赖于神经节细胞的完整，无长突细胞对STR的贡献比较小。Li等[13]在激光光凝大鼠巩膜外静脉造成青光眼模型的研究中，结果表明STR幅值明显的降低，伴有神经节细胞的丢失，再次证明STR直接依赖于神经节细胞的完整。因此，关于STR的准确起源，有人认为STR具有种属依赖性[12]。
由于具体起源现在还不清晰，但是来源位于第三级神经元处已得到认可，多数学者也认为与神经节细胞有密切关系。因此，STR已经广泛的应用于高眼压的研究当中。Bui 等[4]在大鼠眼压急性升高的研究中，认为nSTR反应眼压升高的敏感性要高于pSTR。而Holcombe等[14]在C57BL/J小鼠青光眼模型研究发现，pSTR振幅明显降低，而且pSTR振幅的早期降低是由于神经节细胞功能的异常，并非神经节细胞的死亡导致的，因此pSTR可以灵敏的反应眼压早期的变化。对于以上的研究造成的不一致性，是由于动物种类的原因还是视网膜结构的原因还不清晰。
总之，以上有关STR研究结果的不一致性，还有待于我们深入的研究。鉴于此，建立一个不同条件下的STR标准对于解决以上问题具有重大的意义。在我科室现有的条件下，可以稳定的完整的记录到不同条件下STR，为解决以上不一致性、为更加深入的研究STR以及有关视网膜疾病下STR的变化奠定了基础。
【参考文献】
1 Sieving PA, Frishman LJ, Steinberg RH. Scotopic threshold response of proximal retina in cat. Neurophysiol 1986;(56):10491061
2张作明,顾永昊,郭群,等.小鼠与大鼠视网膜电图和闪光视觉诱发电位记录标准化方案建议.眼科新进展2004;24(2):8183
3 Bayer AU, Cook P, Brodie SE, et al. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Res 2001;41(17):21732185
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8 Naarendorp F, Sato Y, Cajdric A, et al. Absolute and relative sensitivity of the scotopic system of rat: electroretinography and behavior. Vis
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9 Naarendorp F, Sieving PA. The scotopic threshold response of the cat ERG is suppressed selectively by GABA and glycine. Vision Res1991;31(1):115
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11范先群,张芸芸,李海生,等.神经节细胞对暗视阈值反应的研究.中华眼底病杂志1997;13（4）:215218
12 Bui BV, Fortune B. Ganglion cell contributions to the rat fullfield electroretinogram. Physiol 2004;555(1):153173
13 Li RS, Tay DK, Chan HH, et al. Changes of retinal functions following the induction of ocular hypertension in rats using argon laser photocoagulation. Clin Experiment Ophthalmol 2006;34(6):575583
14 Holcombe DJ, Lengefeld N, Gole GA, et al. Selective inner retinal dysfunction precedes ganglion cell loss in a mouse glaucoma model. Br J
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