基于直接标记法抗体微阵列的初步构建
【摘要】 目的：初步构建基于直接标记法的抗体微阵列，并评价其应用于临床的可能性。 方法：选择白蛋白作为目标蛋白，通过琼脂糖铺片、玻片活化、机器点样、点样后固定等步骤构建抗体微阵列，经封闭非特异位点、标记抗原、加样后对白蛋白进行检测，对关键步骤——抗原标记进行最佳条件摸索，通过对临床标本的检测评价其潜在应用价值。结果：应用BCA蛋白定量试剂盒测定尿液样本总蛋白浓度做出的标准曲线，其R2均大于0.99；温度为37 ℃时抗原标记效果最佳；标记后抗原存放1周对信号的影响无统计学意义（P＜0.01）；本方法能够检测出临床检测为阴性的尿微量白蛋白浓度。结论:本研究构建了基于直接标记法的抗体微阵列，并对关键的抗原标记环节进行了最佳工作条件优化，有应用于临床检测的潜力。
【关键词】 抗体微阵列； 直接标记法； BCA蛋白定量； 蛋白标记
抗体微阵列（antibody microarray,AbM）又称抗体芯片，是一种特殊的蛋白质芯片，芯片上固定抗体，通过特异性的免疫反应捕获待测样品中的抗原，从而实现高通量的免疫检测。AbM具有特异性和敏感性高（可达pg·ml-1）、检测范围广（5～250 000 pg·ml-1）、高通量、平行性完成样品的检测等优点。然而，要将其广泛应用于分析复杂样本中低丰度蛋白仍有很多关键性技术亟需解决［12］。基于直接标记的AbM，只需一个抗体即可实现靶蛋白的检测，有别于基于双抗体夹心免疫分析需要抗体对，容易实现多个目标因子检测AbM的构建。本研究旨在构建基于琼脂糖膜载体、直接标记免疫测定的AbM，通过孵育温度、保存时间探讨其关键步骤——抗原标记的最适反应条件，为进一步的技术完善和未来临床应用做准备。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和NHS生物素购自德国Merck公司，单克隆的抗人血清白蛋白抗体购自英国Abcam公司，蛋白定量试剂盒和蛋白酶抑制剂购自美国Pierce公司，链酶亲和素Cy3购自美国Zymed公司，小牛血清白蛋白（bovine serium albumin，BSA）和琼脂糖购自美国Sigma公司，MilliQ超纯水仪和超滤离心管购自美国Millipore公司；点样仪PixSys 5500 arrayer购自美国Packard Bioscience公司，激光共聚焦芯片扫描仪LuxScanTM10K(A)及图像分析软件Spot Data Pro 2.0均购自北京博奥公司。
1.2 方法
1.2.1 载体的制备
制备琼脂糖膜玻片的过程如下：将未处理玻片浸入超纯水中12 h以上，然后在超声清洗仪中以肥皂水清洗1 h、超纯水清洗1 h，最终烘箱烘干玻片以备用。超纯水配制0.5%的琼脂糖溶液100 ml，充分混匀后置微波炉煮沸至溶液透明；取1.5 ml溶液均匀铺至预热的洁净备用玻片上，室温凝固后置37 ℃烤箱烘干备用。
1.2.2 载体的活化
将备用琼脂糖玻片置20 mmol·L-1NaIO4溶液中，室温下摇床慢摇活化30 min，然后以0.01 mmol·L-1 pH 7.4 PBS洗涤5 min×2次、超纯水洗涤5 min×1次,氮气流吹干后即可进行下一步的点样［3］。
1.2.3 点样和固定
抗HSA抗体经点样缓冲液（0.01 mmol·L-1、pH 7.4 PBS溶液，甘油0.2 L·L-1）按一定浓度梯度稀释，通过一定顺序置点样板孔。按预设阵列进行机器点样，点样后玻片置湿盒4 ℃固定。每张玻片阵列设计根据实验需求而定，本实验每张玻片点12个相同的亚阵列，每个亚阵列中有5个样品，各样品重复点样4次。5个样品依次为3个倍比稀释的抗HSA抗体（浓度依次为0.25、0.50、1.0 mg·ml-1）、阴性控制（0.2 mg·ml-1 BSA）和阳性控制（一定浓度的链酶亲和素Cy3），见图1。
1.2.4 样本收集和处理
尿液样本来源于东南大学附属中大医院内分泌科住院病人（临床诊断为糖尿病），留取标本时分两份，1份送医院临床检验中心，1份留作实验用。留取清晨中段尿，离心（3 000 r·min-1×10 min）后取上清液，加入蛋白酶抑制剂和叠氮钠（每1 ml上清液中加入10 μl蛋白酶抑制剂和2 μl叠氮钠），混匀后置-80 ℃冰箱保存以备用。
1.2.5 蛋白质标记
样本和白蛋白标准品均以NHS生物素进行标记，研究表明在AbM这一灵敏度很高的系统中生物素是复杂样本标记的理想选择［4］。首先，将保存于-80 ℃冰箱的尿液样本置室温下解冻，取适量应用BCA蛋白定量试剂盒严格按照使用说明书上的操作流程对样本中总蛋白的浓度进行测定；然后将样本（或标准品白蛋白）和NHS生物素按照质量比为2∶1进行混合，适当温度下孵育一定时间，比较反应温度0、4、25和37 ℃对信号值的影响。将标记混合物移至超滤离心管（0.5 ml,滤过膜截留相对分子质量为30 000），4 ℃ 5 000 r·min-1×10 min离心以清除未结合的生物素。标记后的样本和标准品白蛋白置4 ℃冰箱以备下一步蛋白检测用。比较标记后抗原存放0、24 h以及7 d对信号的影响。
1.2.6 蛋白质检测
1.2.6.1 基于AbM的免疫分析 （1）封闭：取上述已固定玻片以2% BSA/PBS，置37 ℃恒温水浴2 h对非特异性位点进行封闭；（2）PBST洗涤3 min×2次、PB洗涤3 min×1次、超纯水洗涤3 min×1次，氮气流吹干；（3）加样：第1排6个亚阵列依次加一定浓度梯度的生物素标记的标准品各2.5 μl，第2排6个亚阵列分别加生物素标记后样本（每个亚阵列2 μl），置密闭湿盒，37 ℃恒温孵育1 h；（4）洗涤，方法同（2）；(5)对同一玻片不同亚阵列加适量链酶亲和素Cy3，置密闭湿盒，37 ℃恒温孵育25 min；（6）洗涤，方法同（2）。
1.2.6．2 图像扫描与数据分析 激光共聚焦扫描仪扫描（扫描参数：激光功率80%，光电倍增系数PMT 75%），保存图片，行荧光强度数据分析。信号点圆形区域以外信号值作为背景值，最终信号强度（final spot intensities）为原始信号值（original intensities）减去背景值且为4个重复点的平均值［3］。
2 结 果
2.1 应用BCA定量试剂盒对尿液样本中总蛋白浓度定量的标准曲线 以标准品白蛋白0、25、125、250、500、750、1 000、1 500 μg·ml-1按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作，做出检测标准曲线，y=0.002 4+0.024 1x（R2=0.997 8），见图2。
2.2 温度对标记效果的影响
将3份浓度和体积相同的标准品白蛋白按照质量比2∶1与NHS生物素进行混合，分别于0、4、25和37 ℃条件下孵育45 min，将标记混合溶液移至超滤离心管清除未结合生物素。比较4种不同温度标记对信号强度的影响。结果（图3）显示，孵育相同的时间，37 ℃条件下对抗原进行标记的信号强度明显较0、4和图3 不同温度、相同孵育时间对抗原标记效果的影响25 ℃的高。
2.3 标记后样本存放时间对信号强度的影响
比较白蛋白标记后存放0、24 h和1周对检测信号强度的影响。结果显示，标记后白蛋白存放0、24 h和1周后检测到的信号强度差异无统计学意义，见图4。
A～C分别代表同一浓度的标记后抗原保存时间分别为0、24 h和7 d的检测扫描图片；
Ab 500 μg·ml-1组三者比较，P＜0.01；Ab 1 000 μg·ml-1组三者比较，P＜0.01
图4 标记后白蛋白存放时间对信号的影响
Fig 4 The influence of conservation time on the signal intensity
2.4 对临床尿液标本检测的结果
对临床13份尿液标本进行检测，其结果与临床检测结果进行相关性分析，y=0.915 9x（R2=0.919 9，P<0.01），并且能够检测到临床免疫比浊法所检测不到的尿微量白蛋白浓度，见表1。表1 抗体芯片法和免疫比浊法检测尿微量白蛋白的测得值比较
3 讨 论
目前能够对复杂样本（如人血清）中含量极低（pg·ml-1）的蛋白因子进行特异、灵敏、选择性、高通量地检测仍然是非常困难的［5］。为将AbM技术发展成为高通量蛋白组学研究工具，我们［3,68］和其他很多学者［910］都做了很多工作。目前应用AbM进行蛋白定量有两种方法：基于免疫双抗体夹心法，也就是使用两个抗体分别识别同一抗原的不同表位；另一种是使用一个抗体进行检测，即基于直接标记法，需要对待检样品进行标记［11］。前者时常受到抗体对供应的限制，且由于检测1个抗原需两个抗体，较多因子同时检测时容易存在交叉反应；后者由于1个抗体识别1个抗原，检测样本中多个蛋白时各个抗体之间相互影响很小，有利于构建目标蛋白较多的高通量抗体芯片［11］，利于多个因子的平行性检测和相关分析。本研究以我们既往的研究工作为基础，基于琼脂糖膜为载体构建AbM，首先采用直接标记法对蛋白质进行定量分析，优化其关键步骤——抗原标记的反应条件。
对蛋白成分复杂的样本进行标记并不容易［1］，很多因素可能影响标记效果，包括标记物质的选择、标记物质与样本的比例、反应温度、反应时间等，标记后样本保存时间也可能对其产生影响。有研究表明，NHS生物素（或ULS生物素）由于其标记效率高、低背景结合率、未结合物质易清除等优点可以作为标记抗原的首选［5］。本研究采用的标记物质即为NHS生物素，采用的检测靶蛋白为HSA。
Wingren等［5］的研究还表明，以不同总蛋白/生物素摩尔比进行样本标记对信号强度有一定的影响。我们的研究表明，标记白蛋白时蛋白与生物素的最适质量比为2∶1（结果待发表）。标记样本需测定其总蛋白浓度，我们采用的是BSA蛋白定量试剂盒，研究中BSA定量标准曲线的R2均大于0.99，提示定量结果比较可靠。研究以相同标记比例、相同反应时间，比较不同温度（0、4、25和37 ℃）对标记信号的影响。结果表明，37 ℃条件下蛋白质与生物素结合最佳，检测的信号最强，差异有统计学意义（P<0.01）。将标记后样本存放不同时间进行免疫分析，比较存放时间对信号的影响，以判断样本标记后若未能及时检测是否对结果产生明显影响。结果提示，样本标记后立即检测（0 h）和24 h、1周后再检测的信号强度之间的差异无统计学意义。
我们收集了13份临床尿液标本，应用本研究所建立的AbM对其进行尿蛋白浓度测定，结果表明，应用本方法所测得的尿蛋白浓度值与临床免疫比浊法检测值具有非常好的相关性，其检测低限浓度为50 ng·ml-1，说明本实验所建立的检测方法可靠。
总之，本研究首次构建了以琼脂糖膜为载体、基于直接标记法的蛋白定量AbM，并对其关键步骤进行了条件优化。因其具有AbM技术均有的高灵敏度、高特异性等特点，同时具备直接标记技术所带来的高通量优点，能够实现多个感兴趣因子快速、灵敏、特异、平行性检测，可能为我们寻找和发现疾病相关生物标志物研究以及疾病的早期诊断、动态监测、疾病分期、预后判断提供一个很好的技术平台，值得进一步研究。
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