糖尿病大鼠胰腺组织SUR1蛋白表达及药物干预
【摘要】 目的 观察糖尿病大鼠胰腺KATP通道的SUR1亚基蛋白表达变化，以及那格列奈、丹参素对其干预的结果。方法 wistar大鼠高糖高脂饲料加静脉注射链脲佐菌素法建立糖尿病模型后，西药组给予那格列奈(37.5mg/kg体重)，中药组给予丹参素(0.224mg/kg体重)灌胃，4周后摘取胰腺组织，Western blot法检测SUR1蛋白表达改变。结果 模型组SUR1蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)，那格列奈对SUR1蛋白表达表现了一定的上调作用，丹参素对其表达几乎没有影响。结论 胰腺SUR1蛋白表达的降低可能是糖尿病发病的分子机制之一，对其表达的上调是那格列奈的作用机制。
【关键词】 糖尿病 KATP通道 SUR1 那格列奈 丹参素
Proteinic expression of pancreatic SUR1 in diabetes rat and the intervention of drugs(ZHOU Xiaolei，CHEN Yutao，XUE Chengrui. Tianjin General hospital，300052 Tianjin，China.)
【Abstract】 Objective To observe the proteic expression of pancreatic KATP channels SUR1 in diabetes rats，and the Intervention of nateglinide and Danshensu on the changes. Methods Wistar rats were fed high glucose/fat feedstuff and injected STZ into vena caudalis to induce diabetes mellitus. Oral nateglinide was administrated everyone in treatment group by a dose of 37.5mg/(kg*day)，and oral Danshensu was administrated everyone in treatment group by a dose of 0.224mg/(kg*day). 4 weeks later all rats were executed，Using western blot to detect the expression of SUR1 protein. Results The expression of SUR1 in model group was significantly lower than the normal group(P<0.05)，the expression in nateglinide group were still higher than model group(P<0.05)，but the expression in Denshensu group showed no change. Conclusion The diminished expression of SUR1 in pancreatic tissue could be a molecular mechanism of diabetes，nateglinide can attenuate this change in some extent.
【Key words】 Diabetes，KATP channel，SUR1，Nateglinide，Denshensu
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是老年人的常见病、多发病，严重地威胁着老年人的生命与健康，由于老年人自身代谢的特点，目前的许多降糖药常引起低血糖、心血管疾病等不良反应。本研究旨在观察糖尿病大鼠胰腺磺酰脲受体1(sulfonyl urea receptor，SUR1)蛋白表达变化，以及那格列奈、丹参素对其影响，从分子水平探讨糖尿病的发病机制和药物治疗机制。
1. 材料与方法
1.1 动物模型 清洁级雄性wistar大鼠40只，体重270±20kg，予高糖高脂饲料喂养，4周后静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)30mg/kg(用pH为4.4的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成2%的浓度)，空白组注射等量缓冲液，选择空腹血糖大于空白组大鼠+3个标准差作为糖尿病大鼠模型。西药组予那格列奈(37.5mg/kg体重)，中药组予丹参素(0.224mg/kg体重)灌胃;模型组和空白组予等量蒸馏水灌胃，共4周。实验结束时进行口服糖耐量试验，处死动物留取胰腺组织置于冻存管中液氮冷冻后-70℃冰箱保存备用。
1.2 胰腺组织总蛋白的提取 取100mg组织，加入裂解液60μl左右，研磨并放置在冰浴内4℃孵育30min，10000rpm 4℃离心15min，以去除DNA和细胞碎片，将上清液移入一个新的1.5ml离心管内，利用Lowry法进行蛋白定量，在VITALAB Micro半自动生化分析仪上测定各样本蛋白含量后，调整蛋白浓度为10μg/μl。取准备进行电泳的蛋白样品100μl与上样缓冲液100μl等量混合均匀，在沸水中煮5min，恢复至室温后置 -70℃保存备用。
1.3 Western blot SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，取已变性好的蛋白样品(100μg)上样，积层胶电压为80V，30min;分离胶120V，60min。电泳完毕后，转至硝酸纤维素膜，按SUR1一抗1：100、β-actin一抗1：200的浓度加入一抗4℃轻摇孵育过夜，再按SUR1二抗1：1000，β-actin二抗1：2000的浓度加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗室温轻摇孵育1小时。化学发光、VDS450凝胶影像分析系统扫描胶片条带光密度和面积，以SUR1与β-actin条带的光密度积分值的比值来评定SUR1表达水平。
1.4 统计方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，计量资料均以x±s表示，多个样本均数间比较用单因素方差分析(one way ANOVA)，均数间两两比较用LSD检验。
2. 结果
2.1 口服糖耐量试验 0min：各组血糖无显著差异(P>0.05)。30min：各组大鼠血糖较空腹时均有不同程度升高，其中模型组与对照组血糖有统计学差异(P<0.05)，两给药组较模型组有所降低(P>0.05)。60min：模型组血糖值较对照组显著升高，中药组和西药组血糖与模型组相比显著降低(P<0.05);两药物组之间无显著性差异(P>0.05)。120min：西药组血糖显著低于模型组(P<0.05);其他组间比较(P>0.05)。180min：模型组血糖仍高于对照组(P<0.05);其余各组血糖值比较(P>0.05，表1)。
2.2 各组大鼠胰腺组织SUR1蛋白Western blot结果 模型组表达显著低于对照组(P<0.05);西药组较模型组显著增高(P<0.05)，而中药组与模型组比较无显著差异(P>0.05);两给药组比较亦无显著差异(P>0.05，见图1，表2)。
3. 讨论
胰岛β细胞KATP通道是调节胰岛素分泌的重要机制[1，2]，与糖尿病的发病密切相关，由内向整流钾通道6.2(inward rectifying potassium channel，Kir6.2)和SUR1两个亚单位组成。前者形成离子通道，决定通道的生物物理特性，后者调控通道的功能，该通道受ATP/ADP、磺酰脲类化合物(sulfonylureas，SUs)等多种物质调节，关闭引起胰岛β细胞去极化钙内流而触发胰岛素分泌，以前的研究已经证实KATP通道亚单位基因表达的缺陷能够明显影响胰岛素分泌的调节，糖尿病状态下高浓度的葡萄糖在使通道电活动降低的同时[3]，能明显降低Kir6.2和SUR1的mRNA水平，蛋白的表达来源于它的起始编码、转录、翻译等一系列过程，其中的任何环节出现异常或障碍，都会造成蛋白表达的异常，进而影响其生理功能。
那格列奈(nateglinide)是D-苯丙氨酸的衍生物，分子式：C19H27NO3，通过作用于胰岛β细胞KATP通道刺激胰岛素分泌，以往研究表明将SUR1第1237位的丝氨酸取代为酪氨酸后，那格列奈对SUR1/Kir 6.2通道的高敏感性抑制将受到特异性影响，这表明治疗浓度的那格列奈可能通过SUR1抑制胰岛β细胞KATP的。与磺酰脲类降糖药不同，那格列奈的作用具有快开-快闭的特点，而且促胰岛素分泌的反应在血糖正常时比血糖较高时明显降低，类似于正常人在葡萄糖负荷后的胰岛素分泌，由于具有迅速可逆的葡萄糖敏感性[4]，那格列奈不会导致老年人低血糖的发生[5]。此外那格列奈对胰岛β细胞KATP的亲和力较心血管组织KATP高约300倍，其对血管组织KATP的作用比瑞格列奈和格列本脲都小，因此对老年人心血管副作用较小。丹参是多年生草本植物丹参的根，性苦，味微寒，入心经及心包经，功能活血化瘀，有降糖作用。其有效成分丹参素的降糖机制仍然不清，可能与改善微循环，促进β细胞再生和修复有关。本实验结果中模型组空腹血糖升高、OGTT曲线表现为糖耐量减低，意味着STZ诱导的DM模型大鼠胰岛β细胞功能损害的存在。那格列奈明显降低各时间段血糖，显著改善了模型组大鼠的糖耐量减低情况，基本接近正常水平。丹参素降低了餐后60min血糖，而与正常相比还有一定差别，但其对餐后2，3小时血糖影响不大，说明在控制血糖、改善糖耐量异常方面，西药那格列奈具有更好的疗效。
胰腺SUR1蛋白Western blot测定结果显示，模型组表达显著低于对照组。由于胰岛结构本身的破坏，使得胰岛内β细胞数目大大减少，同时β细胞的生理功能也会受到影响，使KATP通道的绝对数量和具有正常生理功能的通道的相对数量都明显减少，因此对通道亚基SUR1的免疫印迹检查表现为显著减弱。那格列奈对其表达表现一定的上调，而丹参素对其表达无显著影响，表明丹参素可能是通过其它机制降低血糖的。那格列奈选择性作用于β细胞KATP通道的SUR1位点，通过抑制该通道，使细胞膜去极化，从而激活细胞内电压依赖性Ca2+通道开放，造成钙内流，细胞内Ca2+浓度增加，进而导致胰岛素快速而短暂释放过程。在正常情况下那格列奈对于KATP通道的作用是抑制和关闭，但实验中那格列奈却表现出对糖尿病大鼠胰岛β细胞SUR1亚基蛋白表达的上调趋势。我们认为这种趋势是上调胰岛β细胞表面具有正常功能通道的趋势，而非绝对数量的增加。此外，不能排除那格列奈还有其他与KATP通道的作用方式或通路，或对该通道的双重作用，类似ATP对胰腺β细胞胰岛素分泌具有的双重调节作用。有研究证实SUR1的磷酸化作用可以减少通道的开放[6]，并能增加细胞膜表面功能性通道的数量，这与本研究中那格列奈对KATP通道的调节相似，而那格列奈是否通过磷酸化机制作用于SUR1，进而由共同调节元件调节Kir6.2的表达有待进一步研究。本研究从分子生物学角度探索糖尿病的发病机制，有助于寻找更为安全有效的降糖药物并阐明其降糖机制。
【参考文献】
1 Kohtaro M，Takashi M，Takashi K，et al. Roles of ATP-Sensitive K+ Channels as Metabolic Sensors Studies of Kir6.x Null Mice[J]. Diabetes，2004，53 (Suppl.3)：S176-S180.
2 Koster J C，Permutt M A，Nichols C G. Diabetes and Insulin Secretion The ATP-Sensitive K+ Channel (KATP) Connection[J]. Diabetes，2005，54(11)：3065-3072.
3 Olofsson C S，Collins S，Bengtsson M，et al. Long-term exposure to glucose and lipids inhibits glucose-induced insulin secretion downstream of granule fusion with plasma membrane[J]. Diabetes，2007，56(7)：1888-1897.
4 Andrea M，Amalia G，James E F，et al.β-Cell Function in Mild Type 2 Diabetic Patients Effects of 6-month glucose lowering with nateglinide[J].Diabetes Care，2005，28(5)：1132-1138.
5 Tiinamaija T，Elina H H，BO I，et al. Improved Prandial Glucose Control With Lower Risk of Hypoglycemia With Nateglinide Than With Glibenclamide in Patients With Maturity-Onset Diabetes of the Young Type 3[J].Diabetes Care，2006，29(2)：189-194.
6 Kang G，Chepurny O G，Malester B，et al. cAMP sensor Epac as a determinant of ATP-sensitive potassium channel activity in human pancreatic βcells and rat INS-1 cells[J]. J Physiol，2006，573(3)：595-609.
订阅登记：
请您在下面输入常用的Email地址、职业以便我们定期通过邮箱发送给您最新的相关医学信息，感谢您浏览首席医学网！