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重组人神经肽Y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究

首席医学网      2009年09月09日 17:39:12 Wednesday  
 

作者：丁克祥 董萍 郑永晨 杨永鹏 朱晓亮 韩晋云 单志新 丁宇 丁振华    作者单位：(南方医科大学科研部，广东 广州 510515)

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【摘要】  目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aNPY转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni2+NTA亲和层析纯化。然后利用相关在线软件进行生物信息学分析NPY蛋白。结果 经IPTG诱导含有pET28aNPY重组质粒的DE3菌，表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni2+NTA亲和层析进行纯化后，得到了较高纯度的融合蛋白。经相关在线软件分析后获得了NPY的相关生物学特性。结论 重组质粒pET28aNPY在大肠杆菌DE3中成功表达，亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白，并对NPY蛋白的生物学特征进行了预测，为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础。

【关键词】  人神经肽Y;融合蛋白;包涵体;纯化;生物信息学

Study on expression, purification and bioinformatic analysis of human neuropeptideY

　　DING KeXiang, DONG Ping, ZHENG YongChen, et al.

　　Scientific Research Department of Southern Medical University, Guangzhou 510515，Guangdong, China

　　【Abstract】 Objective To express human neuropeptideY (NPY) protein in E. coli，purify and identify it，and conduct bioinformatic analysis of NPY protein. Methods The recombinant plasmid pET28aNPY which had been well constructed and sequentially confirmed was transplanted into E. coli BL21 (DE3) and induced by IPTG to express fusion proteins. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify the expressed fusion proteins. The inclusion body of the expressed product was purified by Ni2+NTA affinity chromatography. Then bioinformatic analysis of the NPY protein was conducted with the help of related online software.Results After being induced by IPTG，the DE3 with recombinant plasmid pET28aNPY expressed recombinant human NPY protein. Highly purified NPY fusion protein was obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. Related biological characteristics of NPY were obtained after the online software analysis. Conclusions The recombinant plasmid pET28aNPY can be successfully expressed in DE3. Highly purified proteins can be obtained by Ni2+NTA affinity chromatography. NPY′s biological characteristics are predicted, which lays foundation for further studies of NPY′s biological function and antibody development.

　　【Key words】 Neuropeptide Y; Fusion protein; Inclusion body; Purification; Bioinformatics

 　 人神经肽Y(Neuropeptide,NPY)是一个由36个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢和外周神经系统。此外,NPY也存在于其他组织、器官及腺体中。NPY影响摄食行为、激素分泌、心血管功能、调节体温、生物节律、性行为及情绪等各种生物功能,故越来越受到人们的重视。NPY释放后主要通过NPY受体起作用，不同受体起不同的作用,各组织所含受体种类及分布密度也不相同〔1，2〕。近来研究表明NPY可在局部作用于内皮细胞及脂肪细胞上Y2受体，促进局部脂肪组织生长。而且在NPY的作用下，局部脂肪移植物可存活更长时间不被机体吸收〔3，4〕。据此，理论上不仅可通过局部增加NPY的量，使更多的NPY作用于Y2受体促进该部位脂肪组织的增加;还可通过局部注入NPY抗体，使其中和游离的NPY蛋白，减少NPY与Y2受体的结合而达到该部位脂肪组织减少的效果。即以NPY为靶标，促进脂肪组织的转移。为此,本研究用基因克隆技术在大肠杆菌中制备NPY的融合蛋白,一方面获得高纯度的NPY蛋白，另一方面所得的蛋白制备NPY抗体,以便用于脂肪转移和肥胖代谢综合征的临床前研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 E.coli BL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aNPY的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组人NPY融合蛋白的诱导表达 用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aNPY的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5 ml LB (Kan+)液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日取培养过夜菌液500 μl再接种于50 ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1ml后加入IPTG，终浓度为1 mmol/L，37℃继续诱导培养4 h。取加IPTG前和后的菌液各1 ml，12 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50 μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50 μl，混匀，沸水浴5 min，12 000 r/min离心10 min，每个样品取20 μl上样于15%的SDSPAGE胶上电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2 h，然后脱色，拍照记录结果。

　　1.2.2 包涵体的释放 据上所述，在2 000 ml的摇瓶中装500 ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃以5 000 r/min离心15 min，收集菌体沉淀;加入25 ml PBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃ 12 000 r/min离心30 min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25 ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃ 12 000 r/min离心细菌冻融液30 min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25 ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超声处理，10 min/次，处理时间30 min;超声处理后，于4℃ 12 000 r/min离心30 min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。

　　1.2.3 包涵体的提纯 菌细胞裂解沉淀物中加入含4 mol/L尿素的包涵体提纯液25 ml,吹打混匀，室温静置30 min,12 000 r/min离心30 min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。

　　1.2.4 包涵体的裂解 于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25 ml，吹打混匀，室温静置6h，使包涵体充分裂解,2 000 r/min离心30 min，收集上清液，即为包涵体裂解物。

　　1.2.5 变性蛋白的复性 将收集的包涵体裂解物上清液加入到处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端;将透析袋整体浸没于蛋白复性液，在4℃条件下透析;复性液中的尿素浓度从7～1 mol/L依次递减,在每个尿素浓度梯度复性液中透析3～4 h。每次更换不同尿素浓度复性液之前，需要将透析袋内的样品吸出，在4℃ 12 000 r/min离心30 min，再把上清液加入透析袋内，重新扎紧进行透析;透析完毕后，将样品取出，4℃ 12 000 r/min离心30 min，再将上清液加入透析袋，在4℃预冷的PBS中透析20 h;取出透析好的样品，4℃ 12 000 r/min离心30 min，收集上清液即为复性产物。-70℃保存。

　　1.2.6 复性产物的纯化 ①上样：将复性产物缓慢加于已用PBS缓冲液平衡的镍离子亲和层析预装柱中，加样所用的流速要控制在1 ml/min以内;②冲洗：PBS洗涤除去未结合蛋白，冲洗流速应控制在5 ml/min以内;③洗脱：分别用含50、100、150 mmol/L咪唑PBS缓冲液洗脱融合蛋白，流速5 ml/min。纯化后取20 μl上样于15%的SDSPAGE胶上电泳。

　　1.2.7 纯化产物Western印迹法检测 取纯化后产物20 μl上样于15%的分离胶SDSPAGE电泳后，电转移至硝酸纤维素膜上膜上，进行Western印迹分析。一抗为鼠抗人Anti6×His(1∶1 000稀释)，二抗为辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体(1∶5 000稀释)，采用化学发光法显影，于X光片上曝光。

　　1.3 生物信息学 对所表达的NPY融合蛋白分别利用相关在线软件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)进行氨基酸组成及理化性质分析;利用在线软件(http://ca.expasy.org/tools/protscale.html)进行疏水性分析;利用在线软件(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)进行跨膜分析;利用在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析;利用在线软件(http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)进行二级结构预测;利用在线软件(http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1)对三级结构进行预测;最后利用Harvard大学的在线生物信息学软件(http：//bio.dfci.harvard.edu /Tools /antigenic.html) 进行抗原表位预测。

　　2 结 果

　　2.1 诱导pET28aNPY表达NPY结果 pET28aNPY表达的NPY在N端有非NPY的36个氨基酸的融合蛋白,其中有6个组氨酸的tag(Histag),目的蛋白NPY有36个氨基酸组成，由于设计NPY引物时在编码NPY第36个氨基酸的碱基后紧接着插入了一个终止密码子，因此，pET28aNPY表达的NPY在C端的最后一个氨基酸为目的蛋白NPY的第36个氨基酸。即pET28aNPY表达的完整融合蛋白由72个氨基酸组成,分子量约小于10 kD。pET28aNPY经IPTG诱导结果见图1,在低于10 kD的位置有明显的诱导蛋白表达，NPY重组菌在IPTG诱导前几乎无表达。

　　2.2 融合蛋白纯化后的鉴定 NPY蛋白在含150 mmol/L咪唑PBS缓冲液可以完全被洗脱,分别进行15%的SDSPAGE电泳鉴定 (图2)。

　　2.3 纯化蛋白的Western印迹结果 用化学发光法显影,X光片曝光后可见一清晰条带，表明目的蛋白得到有效表达和纯化,见图3。

　　2.4 NPY的生物信息学分析

　　2.4.1 氨基酸组成及理化性质分析 利用http://www.expasy.ch中的Expasy protparam tool对NPY的理化参数进行预测。预测编码区编码的氨基酸数目为72个。碱性氨基酸总数(Arg + Lys=7)大于酸性氨基酸总数(Asp+Glu=6) 。预测相对分子量为8.09 kD，等电点pI为8.23。其半衰期在体外哺乳动物网织红细胞为30 h，在酵母体内大于20 h，在大肠杆菌体内大于10 h。不稳定系数为53.22，归类为不稳定蛋白。(当一个蛋白质的不稳定系数>40时，则该蛋白质不稳定)

　　2.4.2 疏水性分析 蛋白质分子的基本特性之一是亲水的极性部分在分子的表面，疏水的非极性部分在分子内部。因此,根据每种残基的极性和氨基酸序列就能较容易地了解到一级结构中不同肽段的极性,从而估测出不同肽段在分子内外的定位。用Expasy软件估测了NPY极性,结果见图4。横坐标为蛋白质氨基酸残基的序号,纵坐标表示残基的疏水亲水的特性;正值为疏水,负值为亲水;从图4可以看出,NPY具有较强的亲水性,位于分子的外部。

　　2.4.3 跨膜性分析 膜蛋白主要有两大类:内膜蛋白和外膜蛋白，内膜蛋白与细胞膜结合的主要方式是肽段直接跨过细胞膜，即跨膜蛋白。另外还可以通过脂肪基与细胞膜发生共价结合，蛋白可在胞内，也可在胞外。跨膜蛋白在细胞中常以离子通道形式存在，执行信号传导或物质转运功能。利用在线软件预测，发现有1个跨膜结构区(如图5所示，X轴为氨基酸系列位置，Y轴为氨基酸平均疏水指标) 。

　　2.4.4 信号肽分析 将NPY蛋白序列提交到在线软件分析NPY是否有信号肽存在，输出结果如图6示，NPY蛋白N端1～70位氨基酸序列中发现切割位点位于第28与第29位碱基之间，Y平均值较高，有明显的信号肽序列存在。因此，NPY蛋白是分泌蛋白。

　　图4 NPY的疏水性分析

　　图5 NPY的跨膜性分析

　　图6 NPY的信号肽分析

　　2.4.5 二级结构分析 预测结果如图7所示，表明NPY蛋白的二级结构由26.39%的α螺旋、1.39%的延伸链、72.22%的无规卷曲组成。

　　2.4.6 三级结构分析 蛋白质高级结构的预测和分析，对理解蛋白质结构与功能之间的相关性有着极其重要的意义。将NPY的氨基酸序列提交给SWISSMODEL三级结构预测服务器，预测结果见图8。

　　2.4.7 抗原性分析 利用在线软件对NPY的抗原性进行分析结果如图9所示，有2个抗原决定簇可供选择，以便进行相关实验。

　　3 讨 论

　　NPY的N端和C端各有一个酪氨酸残基和酪氨酰胺残基,C端的酰基化对NPY的生物活性至关重要,N端的酪氨酸残基与稳定NPY的三级结构和结合NPY 受体密切相关。NPY作为一信号分子在不同物种间具有高度的保守性。人体内NPY相关的受体有五种(Y1～Y5),主要存在于中枢神经组织中,此外在外周组织也有分布。其中与脂肪组织相关的受体主要有Y1、Y2、Y5〔3，4〕。NPY通过与Y2的作用刺激内皮细胞增殖分化,在血管生成过程中发挥重要作用〔5～7〕，Kuo等〔4〕的研究表明NPY在脂肪重塑、饮食所诱导的肥胖加剧及伴随的代谢综合症形成中有重要的作用。他们认为NPY与Y2受体相互作用通过血管生成而引起内皮细胞及脂肪细胞的增殖、分化。这表明NPY可作为一介质来增加移植脂肪的体积。Baker〔3〕等的研究进一步表明NPY与Y2受体作用可引起机体内新的脂肪生成,并可减少机体对移植脂肪的吸收。脂肪组织内含有成熟的脂肪细胞及间质细胞。NPY具体作用于成熟脂肪细胞还是作用于间质细胞或者是同时作用于二者后引发相应的生理反应有待进一步研究。

　　脂肪增加对血管生成有一定的依赖性,血管抑制为肥胖的治疗提供了一种新手段〔5〕。VEGF及bFGF对于血管生成及脂肪组织源性干细胞分化形成成熟脂肪细胞也有促进作用〔6〕。这些都为临床脂肪移植研究奠定了基础。脂肪组织要想在所移植部位存活,丰富的血供是必不可少的。其次,在血供保障的情况下如果所移植的脂肪组织细胞能够增殖、分化、进行自我更新的话,那将会弥补被机体吸收掉的那部分脂肪组织,保持移植脂肪的体积不变,即提高其存活率。因此，可将NPY、VEGF及bFGF进行综合研究，以期对脂肪转移在临床应用的探索有实质性进展。

　　笔者利用DNA重组技术克隆了NPY基因〔7〕，且将其与pET28a载体连接后表达于DE3中。即以BL21(DE3)/pET228a+作为表达体系。pET28a表达载体在N端含有HisTag寡聚组氨酸链,因此,表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。本文所设计的NPY融合蛋白N端为36个氨基酸组成的非目的蛋白，其中包含一个Histag，其后的目的NPY蛋白也有36个氨基酸。即pET28aNPY表达的融合蛋白共由72个氨基酸组成,分子量约10 kD左右。用6×Histag抗体进行western印迹鉴定，表明有大量融合蛋白产生。其分子量与NPY融合蛋白相符。目前已完成包涵体的裂解、复性及纯化。其生物学活性还有待测定。此外，笔者利用生物信息学软件对天然NPY在一级结构、二级结构、三级结构等多方面进行了分析和预测,并对其生物学性状有了进一步的了解,为今后以NPY为对象进行的研究准备了物质及理论基础。但是,对于NPY融合蛋白的生物信息学分析尚待进一步研究。

【参考文献】
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　　2 Pittner RA,Moore CX，Bhavsar SP,et al.Effects of PYY〔336〕in rodentmodels of diabetes and obesity〔J〕.Obes Relat Metab Disord,2004;28：96371.

　　3 Baker SB，Cohen M，Kuo L,et al.The role of the neuropeptide Y2 receptor in liporemodeling：neuropeptide Ymediated adipogenesis and adipose graft maintenance〔J〕.Plast Reconstr Surg，2009;123(2):48692.

　　4 Kuo LE，Kitlinska JB，Tilan JU,et al.Neuropeptide Y acts directly in the periphery on fat tissue and mediates stressinduced obesity and metabolic syndrome〔J〕.Nat Med，2007;13:803.

　　5 Movafagh S,Hobson JP,Spiegel S,et al.Neuropeptide Y (NPY) induces migration，proliferation，and tube formation of endothelial cells bimodally via Y1，Y2，and Y5 receptors〔J〕.FASEB J，2006;20：132737.

　　6 Ledoux S，Queguiner I，Msika S,et al.Angiogenesis associated with visceral and subcutaneous adipose tissue in severe human obesity〔J〕. Diabetes，2008;57(12):324757.

　　7 董 萍,丁克祥,杨永鹏,等.与人体肥胖相关的神经肽Y基因的克隆及序列分析〔J〕.国际护理学杂志,2009;28(2):2579.

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